7.2 Особенности морфогенеза в культуре пыльников и микроспор

В ходе естественного формирования пыльцевых зерен (гаметофитный путь развития) у высших растений после мейотического деления материнской клетки пыльцы образуется четыре гаплоидные клетки (тетрада микроспор), которые высвобождаются в полость пыльника после деградации межспоровых оболочек. Микроспоры первоначально имеют расположенное по центру ядро и большое количество мелких вакуолей в цитоплазме. Перед первым митотическим делением вакуоли сливаются в одну большую вакуоль, а ядро смещается к периферии клетки. То есть, происходит поляризация микроспор, в результате чего при митотическом делении образуются две клетки разного размера: большая вегетативная и маленькая генеративная (рисунок 7.1).

Вегетативная клетка получает основную часть цитоплазмы, органелл, РНК и белков микроспоры. Ее ядро находится в деконденсированном состоянии, она содержит в цитоплазме большое количество рибосом и других органелл, наблюдается высокая транскрипционная активность. В ходе интенсивного роста вегетативной клетки вакуоль постепенно уменьшается и исчезает, транскрипционная активность падает, в пластидах накапливается большое количество крахмальных зерен, которые являются источником энергии для развития мужского гаметофита после прорастания пыльцевых зерен (рисунок 7.1).

Генеративная клетка находится внутри цитоплазмы вегетативной клетки, ее ядро в конденсированном состоянии, метаболически неактивном. У нее мало цитоплазмы и всего несколько органелл. Она претерпевает одно симметричное митотическое деление, в результате которого образуется два гаплоидных ядра удлиненной формы – спермии (рисунок 7.1). Один из них оплодотворяет яйцеклетку (образуется диплоидная зигота, в результате деления которой формируется зародыш), а второй – сливается с ядром центральной клетки зародышевого мешка (дает начало триплоидному эндосперму).

Изменение описанной выше программы развития с гаметофитной на спорофитную в культуре in vitro происходит только в том случае, когда микроспоры находятся на определенной стадии развития и являются чувствительными (компетентными) к различным внешним воздействиям, способным вызвать такое изменение программы. Например, для большинства злаков оптимальной фазой для индукции пыльцевого эмбриогенеза является стадия сильно вакуолизированной микроспоры (средняя и поздняя одноядерные микроспоры).

Имеется достаточно много экспериментальных данных, указывающих на связь между андрогенетической способностью генотипа и формированием микроспор определенного типа (эмбриогенных). Было показано, что число эмбриогенных микроспор детерминировано для конкретных растений-доноров пыльников и не увеличивается в ходе культивирования пыльников, а условия культивирования лишь способствуют или препятствуют реализации их развития. Теория, которая считает приоритетной роль эмбриогенных микроспор в процессах андрогенеза в культуре пыльников и микроспор, получила название теории детерминации [Heberle-Bors 1985].

Эмбриогенные микроспоры имеют существенные ультраструктурные и функциональные отличия от нормальных микроспор. Для них характерно смещение вакуоли от центра к экзине на вакуолярной стадии развития микроспор и последующая реадсорбция вакуоли на двухядерной стадии с сохранением ее видимых фрагментов возле экзины; в результате формируется специфическая, так называемая «звездчатая структура» (рисунок 7.2), состоящая из цитоплазматических тяжей, соединяющих перинуклеарную и субкортикальную области цитоплазмы. Отмечается менее плотная цитоплазма, отсутствие накопления крахмальных зерен, характерное для нормальных созревающих генеративных клеток, происходит изменение клеточного цикла. В отличие от нормальных, у эмбриогенных микроспор хроматин вегетативного и генеративного ядер имеет одинаковый уровень конденсации, что говорит об одинаковой транскрипционной активности обоих ядер. Было обнаружено образование в эмбриогенных микроспорах в ходе культивирования in vitro специфической мРНК, не присутствующей в нормальных микроспорах, что говорит о транскрипции у них особых генов, связанных с развитием по спорофитному пути.

Пыльцевой диморфизм (присутствие в созревающей пыльце нормальных и эмбриогенных микроспор) проявляется и на уровне зрелой пыльцы [Horner, Street 1978]. Нормальные пыльцевые зерна содержат много крахмала, интенсивно окрашиваются ацетокармином (вегетативное и генеративное ядра не просматриваются). Пыльцевые зерна, происходящие от эмбриогенных микроспор, по размеру меньше нормальных, имеют слабое окрашивание цитоплазмы ацетокармином, у них отсутствуют крахмальные зерна; они содержат четко различимые вегетативное и генеративное ядра, или одно ядро, или два одинаковых ядра (рисунок 7.3). Такие зерна получили название р-зерна (от англ. pre-mitotic). Благодаря пыльцевому диморфизму имеется возможность проводить предварительную оценку андрогенетической способности генотипов на основе цитологических данных изучения препаратов зрелой пыльцы, оценивать эффективность воздействия на растения-доноры пыльников тех или иных средовых факторов до начала культивирования пыльников или микроспор.

Изучение поведения микроспор в процессе культивирования in vitro показало, что большинство из них дегенерирует в течение нескольких дней после помещения пыльников на питательную среду. Лишь эмбриогенные микроспоры претерпевают последовательные митотические деления, давая начало новообразованиям (каллюсу или эмбриоидам). Выявлено несколько путей формирования эмбриоидов или каллюса из эмбриогенных микроспор [Aionesei et al. 2005].

А-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению. В дальнейшем происходят симметричные деления только вегетативной клетки, в результате чего образуются гаплоидные эмбриоиды. Генеративная клетка не делится и погибает. Этот механизм впервые был описан у культуры пыльников табака (Sunderland, Wicks 1971) и был преобладающим в случае культивирования пыльников, содержащих молодые двуядерные микроспоры. Образование эмбриоидов или каллюса из вегетативной клетки позднее было продемонстрировано и у ряда других видов (рапс, паслен, дурман, люфа и др.), при этом у некоторых из видов (ячменя, пшеницы, кукурузы, риса и ржи) отмечено формирование каллюса.

Е-путь. Микроспора подвергается первому неравному митотическому делению, в дальнейшем происходят симметричные деления генеративной клетки. В результате образуются гаплоидные эмбриоиды или каллюс. Впервые этот механизм был описан у культуры пыльников белены черной Hyasciamus niger [Raghavan 1976], позднее и у других видов (ячменя, кукурузы, пшеницы, риса). Возможно также развитие многоклеточных структур, представляющих собой химеру из клеток, происходящих от деления как генеративной, так и вегетативной клеток.

В-путь. Первое митотическое деление, в отличие от нормального, является симметричным, что приводит к формированию двух одинаковых вегетативных клеток. Их последующее митотическое деление ведет к образованию многоклеточных структур. Этот механизм преобладает при образовании гаплоидных эмбриоидов у дурмана Datura innoxia и рапса Brassica napus. Однако он обнаружен и других видов, особенно в случае использования стрессовых воздействий на культивируемые микроспоры. Предполагается, что одной из причин симметричного деления является отсутствие или формирование слаборазвитой вакуоли при первом делении микроспоры. Это может происходить у некоторых видов растений под действием температурного стресса (типичный случай – холодовое воздействие на одноядерные микроспоры дурмана Datura innoxia). При отсутствии вакуоли не происходит смещение ядра к периферии клетки, нарушается ее полярность. При В-пути развития микроспор клеточная оболочка после деления ядер, как правило, не формируется, ее закладка происходит после образования многоядерных структур. В связи с этим может происходить слияние равных ядер и увеличение плоидности (спонтанное удвоение хромосом). Развитие по В-пути обычно приводит к формированию гаплоидных или диплоидных эмбриоидов (удвоенных гаплоидов).

С-путь. Микроспора претерпевает нормальное митотическое деление, в результате которого формируются вегетативное и генеративное ядра. Затем ядра сливаются, последующие митотические деления приводят к образованию многоклеточных структур, которые в дальнейшем развиваются посредством эмбриоидогенеза или каллюсогенеза, давая начало преимущественно удвоенным гаплоидам. При слиянии эндоредуплицированных ядер могут формироваться эмбриоиды, имеющие большую плоидность, однако они погибают на ранних стадиях развития.

Таким образом, в результате развития эмбриогенных микроспор по одному из этих путей могут образовываться как гаплоидные, так и диплоидные эмбриоиды (удвоенные гаплоиды). Во многих случаях в культуре пыльников или микроспор образуются не эмбриоиды, а каллюс, из которого также могут быть регенерированы и гаплоидные, и диплоидные растения. Считается, что получение удвоенных гаплоидов связано со спонтанным удвоением хромосом. Частота появления удвоенных гаплоидов может колебаться в значительных пределах в зависимости от вида растений, использованных генотипов, методов культивирования микроспор. Например, частота спонтанного удвоения хромосом варьировала от 0 до 21% у различных генотипов кукурузы, от 10 до 40% - у рапса Brassica napus. У некоторых сортов ячменя она достигала 87%.

Механизм спонтанного удвоения хромосом в процессе пыльцевого эмбриогенеза в большинстве случаев неясен. В литературе описаны примеры эндоредупликации (удвоения ДНК без митоза), эндомитоза (митоза без образования веретен деления и разрушения оболочки ядра), слияния ядер. Тем не менее, появление спонтанных удвоенных гаплоидов имеет важное практическое значение, поскольку предоставляется возможность получать гомозиготные линии, избежав трудозатрат, связанных с искусственным удвоением хромосом у гаплоидов.