7.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность андрогенеза в культуре пыльников и микроспор

Роль генотипа. Способность к андрогенезу в культуре пыльников и микроспор существенно различается у разных видов растений. У большинства двудольных растений получить гаплоиды с помощью этого метода проще, чем у однодольных. В свою очередь, среди двудольных наиболее высокую андрогенетическую способность имеют представители семейств пасленовых и крестоцветных. В пределах вида имеются генотипы, значительно различающиеся по этому показателю.

Показано на многих видах растений, что различные этапы андрогенеза (индукция эмбриогенеза и регенерация растений) находятся под контролем разных генов. Отдельным генетически детерминированным признаком является также выход зеленых растений-регенерантов. Этот признак имеет особое значение для злаковых культур, у которых преобладают альбиносные растения-регенеранты.

Как правило, гибриды превосходят по андрогенетической способности родительские формы (гетерозис), однако могут и уступать им. Характер наследования показателей пыльцевого эмбриогенеза различается в зависимости от вида растений и набора изучаемых генотипов. Во многих случаях наблюдали наследование по доминантному или сверхдоминантному типу в сторону высокого выхода эмбриоидов. В других случаях наследование этих признаков было аддитивным.

В исследованиях на пшенице было показано, что индукция пыльцевого эмбриогенеза находится под контролем генов, расположенных на хромосомах 7А и 1В, регенерацию растений из эмбриоидов контролируют хромосомы 3А и 5В, а выход зеленых растений-регенерантов зависит от генов хромосомы 2D [Barnabas et al. 2001].

Сравнение транскриптома с помощью микрочипа Barley1 Gene Chip линий ячменя, близких по происхождению, но c разной андрогенетической способностью, позволило идентифицировать у них различия в экспрессии 213 генов. Гены, связанные со способностью микроспор к делению и образованию эмбриоидов, относились к генам, вовлеченным в процессы изменения структуры и функции мембран, эффективного использования энергии. Образование зеленых регенерантов было связано с экспрессией генов ответа растения на стресс, регуляции транскрипции и трансляции, деградации специфичных пыльцевых протеинов, а альбиносных растений – генов, вовлеченных в процесс развития пластид [Munos-Amatriain et al. 2009].

По мнению Uhrig и Salamini (1987) андрогенетическая способность у сортов и внутривидовых гибридов культурного картофеля контролируется немногими или, вероятно, одним доминантным геном. Аналогичные результаты получены в экспериментах с диплоидными видами картофеля. По данным Veronneau et al. (1992) на S. chacoense, формирование эмбриоидов в культуре пыльников находится под контролем двух генов, еще два гена контролируют процесс регенерации растений из эмбриоидов. Taylor и Veilleux (1992) установили, что процесс регенерации эмбриоидов в культуре пыльников S. phureja контролируется одним доминантным геном, но при этом способность к андрогенезу in vitro находится под влиянием аддитивного влияния других генов.

Помимо ядерных генов, на эффективность андрогенеза могут оказывать влияние и цитоплазматические факторы, что было установлено в опытах на аллоплазматических линиях пшеницы (получены методом беккросса путем замещения цитоплазмы одного вида пшеницы на цитоплазму другого вида) [Орлов 2006]. Таким образом, андрогенетическая способность генотипа – комплексный признак, в генетическом контроле которого могут участвовать разные гены и генетические системы.

Влияние физиологического состояния и условий выращивания растений-доноров пыльников на эффективность андрогенеза. Условия выращивания растений, их физиологическое состояние могут оказывать весьма существенное влияние на выход гаплоидов или удвоенных гаплоидов в культуре пыльников или микроспор. В связи с этим нередки случаи, когда в разные годы или при выращивании в разных условиях растений одних и тех же генотипов получают сильно различающиеся результаты. Считается, что более высокий выход гаплоидов получают в культуре пыльников от выращиваемых в поле растений по сравнению с тепличными. Однако, во многих случаях из-за сильной контаминации культур, полученных от выращиваемых в поле растений, предпочтительным является использование теплиц. Кроме того, при выращивании в теплицах имеется возможность контролировать ряд важных для андрогенеза факторов среды: интенсивность освещения, его качество (спектральный состав света) и продолжительность (фотопериод), температуру выращивания растений, их питание и полив. В любом случае растения-доноры пыльников должны быть в здоровом состоянии, получать полноценный уход.

Heberle-Bors и Reinert (1981) показали, что при выращивании растений табака Nicotiana tabacum в условиях короткого дня и пониженных температур происходит существенное увеличение концентрации в пыльце эмбриогенных р-зерен и, соответственно, увеличение частоты эмбриоидов в культуре микроспор. На основании полученных результатов было высказано предположение, что образование р-зерен – тип мужской стерильности, формирующейся под воздействием во время мейоза материнских клеток пыльцы факторов внешней среды, оказывающих на растения феминизирующий эффект (Heberle-Bors 1982). Это предположение было подтверждено позднее в опытах по обработке разных видов растений физиологически активными веществами, сдвигающими пол в женскую сторону.

В лаборатории генетики картофеля ИГиЦ НАН Беларуси было проведено сравнение эффективности воздействия различных феминизирующих агентов (цитокининов - 6-БАП, кинетина; ауксинов - НОУК, 2,4-Д; а также хлорхолинхлорида и алара, обладающих антигиббереллиновой активностью) на процесс андрогенеза в культуре пыльников сортов картофеля. Лучшие результаты были получены при обработке формирующихся бутонов раствором 6-БАП (20-30 мг/л): наблюдали достоверное увеличение в зрелой пыльце сорта доли р-зерен и увеличение интенсивности андрогенеза в 2-3 раза по сравнению с контролем [Yermishin et al. 1989].

В качестве эффективного приема повышения андрогенетической способности сортов картофеля было предложено использовать прививку на томаты [Ермишин, Воронкова 1996]. Если для интактного растения картофеля характерна большая листовая поверхность (место синтеза гиббереллинов) при относительно слаборазвитой корневой системе (место синтеза цитокининов), то в результате прививки получается растение с мощной корневой системой подвоя (томатов) и небольшой листовой поверхностью привоя. Следовательно, можно предположить, что микроспорогенез у привоя происходит в гормональном режиме, существенно отличающемся от такового интактного растения картофеля (сдвиг полового баланса в женскую сторону из-за изменения соотношения между цитокининами и гиббереллинами). По сравнению с применением опрыскиваний растений фитогормонами, прививка картофеля на томаты имеет ряд преимуществ: исключается эффект неравномерного попадания физиологически активных веществ на разные части соцветия, обеспечивается постоянное воздействие фитогормонов на созревающие микроспоры.

Изучение влияния различных факторов внешней среды на андрогенетическую способность растений позволило идентифицировать для разных видов способы воздействий, позволяющие существенно усилить у них формирование эмбриогенных микроспор и увеличить выход гаплоидов в культуре пыльников и микроспор. Так, высокотемпературный стресс (воздействие в фазу бутонизации на растения с течение двух суток температурой 32°С) был успешно использован для повышения андрогенетической способности растений рода Brassica, ряда пасленовых культур [Zoriniants et al. 2005], в том числе некоторых клонов S. phureja. Однако для сортов картофеля S. tuberosum этот прием оказался неэффективным. После такого стресса наблюдалось полное осыпание формирующихся бутонов. В отличие от высоких температур, воздействие холода (2 суток при температуре 4°С) оказалось весьма благоприятным. При этом наблюдали не только значительное (до 30%) увеличение концентрации эмбриогенных р-зерен, но и одновременное увеличение пыльцевой продуктивности растений. Оба эти фактора, очевидно, оказывали положительное влияние на андрогенетическую способность картофеля и позволили существенно повысить выход каллюса в культуре пыльников [Ермишин, Воронкова 1990].

Существенное влияние на эффективность андрогенеза in vitro у растений имеет характер освещения растений-доноров пыльников. В исследованиях лаборатории генетики картофеля Института генетики и цитологии НАН Беларуси было показано, что при выращивании растений картофеля в условиях теплицы с досветкой лампами ДРИ-2000-6 значительно повышалась андрогенетическая способность практически всех исследованных сортов картофеля (Таблица 7.1) [Ермишин, Воронкова 1989].

Таблица 7.1 Показатели андрогенетической способности сортов картофеля в зависимости от источника освещения растений-доноров пыльников (естественное освещение и подсветка лампами ДРИ-2000-6)
Сорт	Частота каллюсо-образования (% от числа эксплантированных пыльников)		Концентрация Р-зерен в зрелой пыльце %		Пыльцевая продуктивность (масса пыльцы с 10 цветков ) мг
	Естест- венное освеще- ние	Подсветка лампами ДРИ-2000-6	Естест- венное освеще- ние	Подсветка лампами ДРИ-2000-6	Естест- венное освеще- ние	Подсветка лампами ДРИ-2000-6
Ирис	16,88	66,06**	0,38	1,31**	3,10	17,60
Отрада	0	59,58**	0,94	3,40**	20,45	41,70
Ласунак	32,40	50,40**	1,52	2,11**	8,90	27,00
Ясень	2,72	24,85**	0,88	2,33**	7,90	12,37
Зорька	7,79	36,55**	0,82	3,04**	4,80	9,20
Орленок	1,54	25,14**	0,14	1,13**	20,00	42,00

** Р ≤ 0,01

Эффект воздействия света, излучаемого этими лампами, по-видимому, связан с преобладанием в его спектре коротковолнового (синего – 430 - 490 нм) излучения с тремя максимумами при 400, 500 и 600 нм и сильно пониженной интенсивностью излучения в инфракрас­ной области (700 – 760 нм). По-видимому, это усиливало синтез в растениях цитокининов, что, как отмечалось выше, может приводить к сдвигу пола в женскую сторону и стимулировать образование эмбриогенных микроспор.

Таким образом, экспериментальные воздействия на растения-доноры пыльников на стадии мейоза позволяют существенно усилить образование эмбриогенных микроспор. Это позволяет сделать вывод, что на этой стадии растения являются чувствительными к внешним воздействиям для изменения программы развития микроспор с гаметофитной на спорофитную.

Оптимальная фаза развития микроспор для индукции андрогенеза. Как отмечалось выше, изменение программы развития с гаметофитной на спорофитную в культуре in vitro возможно, только когда микроспоры являются компетентными к условиям культивирования, способным вызвать такое изменение программы. Для большинства видов растений это стадия одноядерной микроспоры. Однако в некоторых случаях лучшие результаты были достигнуты при использовании микроспор, находящихся на более ранних (во время, или сразу после мейоза) или поздних (двуядерная микроспора) стадиях развития. В каждом конкретном случае оптимальная для индукции андрогенеза стадия развития микроспор определяется экспериментально с помощью цитологических методов. Поскольку делать это для каждого эксплантируемого пыльника невозможно, используют различные внешние критерии для отбора пыльников, большинство микроспор в которых находится на оптимальной для андрогенеза стадии. Например, берут бутоны определенного размера, или колосья, когда они только появляются из под флагового листа.

Эффект стрессовых воздействий на растения, эксплантаты или микроспоры до начала культивирования пыльников или микроспор (предобработки). Впервые положительный эффект предобработки растений холодом на выход гаплоидных эмбриоидов в культуре пыльников и микроспор дурмана Datura innoxia обнаружили Nitsch и Norreel (1973). Как показали дальнейшие исследования, эффект холодового стресса на стадии одноядерной микроспоры выражался в увеличении частоты симметричных митозов микроспор и, как следствие, увеличении выхода эмбриоидов за счет развития микроспор по пути B (см. выше 7.2). В настоящее время холодовая предобработка эксплантатов для культуры пыльников или микроспор является одним из обязательных элементов технологии получения андрогенетических гаплоидов многих видов растений.

Существует несколько вариантов применения этого методического приема. Воздействию холодом подвергают целые растения (редко, из-за трудоемкости), срезанные побеги с бутонами, или колосьями на стадии одноядерной микроспоры, помещенные в сосуды с водой или питательной средой (используют чаще всего), бутоны или колосья, помещенные в чашки Петри, эксплантированные пыльники. Обычная температура – около 4^оС (температура в бытовых холодильниках), продолжительность – от 1 до 30 суток.

Помимо холодовой обработки, нашли применение и другие стрессовые воздействия, которые используют в зависимости от вида растений: тепловой стресс (температура 32-38 ^оС, продолжительность от нескольких часов до нескольких дней), инкубирование пыльников или микроспор на питательной среде, содержащей неметаболизируемые источники углеводов, например, маннитол (углеводное голодание), с пониженным содержанием азота (азотное голодание), на среде с добавлением колхицина. Реже в качестве стрессовых воздействий используют центрифугирование эксплантатов, пониженное атмосферное давление, γ-облучение, инкубирование пыльников на питательной среде с высокой рН, с абсцизовой кислотой, полиэтиленгликолем, этанолом, в присутствии тяжелых металлов и др. Также применяют комбинации стрессовых воздействий, например, тепловой стресс плюс углеводное и азотное голодание.

Наблюдения, сделанные на разных растительных системах показали, что вне зависимости от типа использованного стрессового воздействия образование эмбриогенных микроспор сопровождается: 1) увеличением размера микроспор; 2) репликацией ДНК или митозом, после которых происходит остановка клеточного цикла; 3) уменьшением объема цитоплазмы; 4) перемещением ядра микроспоры с периферии к центру; 5) фрагментацией вакуоли и образованием цитоплазматических тяжей, идущих от ядра к периферии клетки (формирование «звездоподобной» структуры (рисунок 7.2)); 6) образованием новой клеточной стенки с внутренней стороны существующей; 7) увеличением компактности хроматина; 8) изменением активности генов.

Механизмы, которые индуцируют описанные изменения микроспор, и каким образом эти изменения определяют перепрограммирование микроспор на спорофитный путь развития, пока неизвестны. Тем не менее, имеющейся информации достаточно, чтобы сделать вывод, что стадия одноядерной микроспоры (или ранней двуядерной для некоторых видов) является, наряду со стадией мейоза, второй «чувствительной точкой» микроспорогенеза, когда такое перепрограммирование возможно в ответ на действие внешних воздействий, в качестве которых эффективными оказываются различные стрессы. Все это позволяет рассматривать предобработку растений или генеративных органов перед помещением пыльников или микроспор на питательную среду для культивирования в качестве одного из наиболее важных элементов технологии получения андрогенетических гаплоидов.

Выбор питательной среды и условий культивирования пыльников или микроспор. После того, как запущен механизм перепрограммирования микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития, важно создать благоприятные условия для индукции их делений и образования эмбриоидов или каллюса. Оптимальная температура культивирования пыльников или микроспор обычно не сильно отличается от той, при которой производят культивирование соматических клеток того же вида растений. Считается, что для индукции эмбриогенеза освещение культур не требуется, однако во многих случаях пыльники или микроспоры культивируют на свету (под лампами дневного света), что, как полагают, может стимулировать процесс эмбриогенеза. Сформировавшиеся эмбриоиды для получения растений-регенерантов требуют обязательного освещения, причем необходима оптимизация интенсивности освещения, его продолжительности, подбор источника света с оптимальными спектральными характеристиками света. Подсветка культур необходима также при получении растений-регенерантов из каллюса пыльцевого происхождения.

Культивирование пыльников удобно проводить в пластиковых чашках Петри диаметром 5 см, заклеенных парафильмом. На поверхность агаризованной среды высаживают 10-15 пыльников. В последнее время предпочтение отдается жидким средам, средам с половинным, по сравнению с обычными средами содержанием агара или агарозы (полужидкие среды), или двухслойным средам с нижней агаризованной подложкой и верхним слоем жидкой среды, в которой пыльники свободно плавают. Было показано, что при культивировании пыльников на жидких средах вероятность прямого эмбриогенеза выше, чем на агаризованных. Микроспоры культивируют в тонком слое жидкой питательной среды. При получении культуры микроспор большое значение имеет исходная плотность клеток. Для культуры микроспор пшеницы эффективной является плотность от 5×10³ до 2×10⁵ на мл среды.

В качестве основной питательной среды для культуры пыльников или микроспор чаще всего используют среду Мурасиге-Скуга или ее модификации, а также среду Нич-Нич [Nitsch, Nitsch, 1969]. Для злаковых культур рекомендуют среду N6, разработанную китайскими исследователями (Chu, 1978). Большое распространение получила для злаковых также китайская картофельная среда (она содержит картофельный экстракт, который получают путем продолжительного отваривания молодого картофеля) [Chuang et al. 1978]. Концентрацию сахарозы, как правило, повышают с обычных 2-3% до 6-8%. В последнее время принято вместо сахарозы использовать мальтозу, которая более стабильно поддерживает осмотические свойства питательной среды и дает возможность получать эмбриоиды с более высокой жизнеспособностью. Для культуры микроспор в питательную среду добавляют осмотики (например, для культуры микроспор пшеницы это 0,3М маннитол или 0,25М мальтоза).

Показано, что могут различаться требования разных генотипов к уровню отдельных мак­ро- и микроэлементов, соотношению азотсодержащих солей, добавке в состав среды определенных аминокислот (например, глютамина, аспарагина, серина в качестве источников азота), адсорбирующих агентов (например, активированного угля, поливилипирролидона и др.). Индукционные питательные среды для культуры пыльников или микроспор двудольных растений в качестве обязательных компонентов содержат в разных соотношениях регуляторы роста (ауксины и цитокинины). У злаковых для индукции эмбриогенеза достаточно небольшого количества ауксина (0,1-0,2 мг/л 2,4Д, более высокие концентрации приводят к образованию преимущественно каллюса).

Для культуры микроспор важным фактором индукционной питательной среды является кокультивирование микроспор с изолированными семяпочками или кондиционирование ее питательной средой, на которой проводили культивирование завязей (OVCM – ovary-conditioned medium). Этот прием способствует выходу эмбриоидов из экзины микроспор, повышает их жизнеспособность, благодаря чему удается получить андрогаплоиды даже у «неотзывчивых» генотипов.

Сформировавшиеся в культуре пыльников эмбриоиды, как правило, развиваются на свету в растения-регенеранты. В отдельных случаях для улучшения условий регенерации или для лучшего укоренения регенерантов их переносят на специальную регенерационную питательную среду. Перенос на регенерационную среду необходим и для получения растений-регенерантов из каллюса. Регенерационная среда содержит, в отличие от индукционной, обычное для культуры соматических клеток количество сахарозы (2-3%), а также регуляторы роста, необходимые для индукции морфогенеза из каллюса. Эмбриоиды, сформировавшиеся в культуре микроспор, для регенерации растений переносят на полужидкую среду с пониженным содержанием сахаров и без регуляторов роста. Сформировавшиеся растения-регенеранты после процедуры адаптации (см. главу 5) высаживают в грунт.

7.5 Определение плоидности растений-регенерантов. Получение удвоенных гаплоидов, оценка их гомозиготности

Полученные растения-регенеранты могут быть гаплоидами, удвоенными гаплоидами (в результате спонтанного удвоения хромосом, это оптимальный вариант) или иметь иную плоидность (анеуплоиды и полиплоиды). Наиболее простой метод отделить гаплоиды от диплоидов и полиплоидов – по внешнему виду: сеянцы гаплоидов в большинстве случаев явно уступают в мощности и скорости развития. Гаплоиды являются стерильными и не завязывают семян при самоопылении. Еще один простой метод определения плоидности основан на подсчете числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц листа [Frandsen, 1968]. Так, у моноплоидов картофеля (n=x=12) это число равно 5-6, у дигаплоидов (2n=2x=24) – 10-13, у тетраплоидных сортов (2n=4x=48) – от 22 до 30. Точно определить плоидность позволяет подсчет числа хромосом в метафазных пластинках молодых корешков растений-регенерантов, или в мейотических материнских клетках пыльцы на стадии метафазы - анафазы II или пыльцевого митоза. Ускорить этот процесс можно путем анализа ядер клеток растений-регенерантов с помощью проточной цитометрии (англ. flow cytometry) (рисунок 7.4).

В случае, если растения-регенеранты являются гаплоидами, проводят у них удвоение хромосом. Наиболее распространенная методика основана на применении колхицина. Колхицин – алкалоид, выделенный из безвременника (Colchicum autumnale), обладающий свойством ингибировать полимеризацию микротрубочек, формирующихся при клеточном делении, что приводит к нерасхождению хромосом и, в результате, увеличению плоидности клеток. Для удвоения хромосом у высаженных в грунт растений-регенерантов, например, ячменя, молодые стеблевые меристемы обрабатывают раствором, содержащим 0,05-0,1% колхицина и 2% диметилсульфоксида. Для этого на меристемы прикладывают вату, смоченную таким раствором, или наносят ланолиновую мазь на его основе. Обработки повторяют несколько раз в течение вегетации. Колосья, образовавшиеся из обработанных меристем, содержат диплоидные сегменты, на которых формируются фертильные цветки. Поскольку колхицин является сильно токсичным соединением, вместо него применяют другие вещества с аналогичным действием, например кофеин, гербициды оризалин, амипрофосметил, трифлуралин, пронамид.

Для удвоения хромосом используют также закись азота. Гаплоидные растения на стадии формирования цветочных примордий помещают на 2 суток в специальную камеру, в которую закачивают закись азота и повышают давление до 600 кПа. Еще один метод удвоения хромосом основан на получении каллюсных культур гаплоидных растений с последующей индукцией из каллюса адвентивных побегов. Как известно, эндомитоз (удвоение хромосом без клеточного деления) – обычное явление для культуры клеток растений (см. раздел 3.3, 6.1). Этот подход показал высокую эффективность для картофеля, лука.

Диплоидные растения-регенеранты могут получиться не только благодаря спонтанному удвоению хромосом гаплоидных клеток, но и в результате регенерации из каллюса, происходящего из соматических клеток генеративных органов. Такие растения не будут удвоенными гаплоидами, а будут иметь генотип материнского растения. Вероятность их появления в целом невелика, особенно в случае развития микроспор с образованием эмбриоидов. Тем не менее, иногда требуется подтверждение гомозиготности полученных предположительно удвоенных гаплоидов. Для этого, во-первых, необходимо убедиться, что генотип анализируемых растений отличается от генотипа растений-доноров пыльников (чаще всего это гибриды), во-вторых, их половое потомство имеет высокую однородность, характерную для удвоенных гаплоидов. Для этих целей используют как морфологические, так и биохимические (изоферментные формы) и молекулярно-генетические (AFLP, RAPD, SSR и другие) маркерные признаки.