2. Дифференциальная окраска хромосом

В зависимости от целей цитогенетического исследования исполь­зуются различные методы окрашивания хромосом. Наиболее рас­пространенными из них являются рутинная или обычная окраска и ряд методов дифференциального окрашивания хромосом: Q-, G-, С-, R- и NOR- или Ag-окраска. В свою очередь, методы диф­ференциального окрашивания делятся на 2 группы: 1) приводящие к образованию сегментов вдоль длины всех хромосом (например, Q-, G- или R-сегменты); 2) приводящие к окрашиванию специфищеских хромосомных структур, благодаря чему можно выявить отдельные сегменты.

• Рутинная окраска хромосом достигается путем простого окра­шивания полученных хромосомных препаратов красителем Романовского-Гимза (азур-эозином), без какой-либо их предварительной об­работки. Такая окраска приводит к сплошному прокрашиванию хро­мосом по длине, что не позволяет идентифицировать разные мор­фологически сходные хромосомы набора. Исторически рутинная ок­раска была самой первой используемой в цитогенетике человека окраской, активно применяющейся в течение 1959-1970 гг., до вне­дрения методов дифференциального окрашивания хромосом. В на­стоящее время она практически не применяется для диагностики кон­ституциональных хромосомных нарушений, однако находит применение при анализе хромосомных аберраций в тестировании факто­ров среды на мутагенную активность.

• Q-окраска (от англ. Quinacrine - акрихин) выявляется на хромо­сомах в виде чередования ярко- и темно-флюоресцирующих полос с помощью флуоресцентной микроскопии хромосомных препаратов, окрашенных такими флюорохромами (флуоресцентными красителя­ми) как производные акридина - акрихин дигидрохлорид (атебрин) или акрихин-иприт. Эти красители обладают способностью присое­диняться к ДНК путем интеркаляции или с помощью внешних ион­ных сил. Q-окраска имеет свою кодировку (QFQ) по международной цитогенетической номенклатуре. Заслуга применения производных акрихина для получения Q-сегментов на хромосомах человека при­надлежит шведскому цитогенетику Касперссону (1970). В популяци­ях человека существует межиндивидуальная вариабельность отдель­ных участков хромосом, выявляемых с помощью Q-окраски – Q-полиморфизм хромосом. Он выражается в особенно ярко светя­щихся сегментах, локализованных в центромерных участках (сеn) хро­мосом 3 и 4, а также в коротких плечах (р11) и спутниках (р13) всех акроцентрических хромосом человека 13-15 ,21 и 22. Кроме того, у лиц мужского пола ярко флюоресцирующейся областью является и дистальная часть длинного плеча хромосомы Y - сегмент q12. Этот участок Y-хромосомы обладает выраженным межиндивидуальным полиморфизмом и четко наследуется по мужской линии. Все пере­численные ярко флюоресцирующие участки хромосом являются об­ластями локализации гетерохроматина – некодирующих повторяю­щихся последовательностей ДНК, вариабельность которых не при­водит к каким-либо фенотипическим изменениям. Указанные выше ярко флюоресцирующие Q-полиморфные хромосомные сегменты являются удобными цитогенетическими маркерами и могут быть ис­пользованы как для характеристики популяций, индивидов и клеточ­ных линий, так и для решения некоторых судебно-медицинских про­блем.

• G-окраска (от англ. Giemsa – Гимза) выявляется благодаря пред­варительной обработке хромосомных препаратов слабым раствором протеолитического фермента трипсина и последующей окраске кра­сителем Гимза. При этом наблюдается полосатая исчерченность хро­мосом, где темные полосы в некоторой степени соответствуют гете­рохроматиновым районам, а светлые – эухроматиновым. G-окраска имеет свою кодировку (GTG) по международной цитогенетической номенклатуре. Оптимальные условия окраски находят в каждой ла­боратории эмпирическим путем. Методика G-окраски хромосом че­ловека была впервые предложена английской исследовательницей Мариной Сибрайт (Seabright) в 1972 году и практически в неизмен­ном виде используется до настоящего времени. По числу, величине и расположению выявляющихся сегментов рисунок G-окраски ана­логичен рисунку при Q-окраске, где темно окрашенные G-сегменты соответствуют флюоресцирующим Q-сегментам. Различия состоят в том, что: а) несветящиеся гетерохроматиновые центромерные сег­менты в хромосомах 1 и 16 хорошо прокрашиваются красителем Гим­за; б) ярко флюоресцирующие при Q-окраске сегменты 3, 4, 13-15, 21, 22 и Y-хромосом не выделяются особой интенсивностью при G-окраске. На G-окрашенных метафазных хромосомах выделяется око­ло 320 сегментов на гаплоидный геном.

• R-окраска (от англ. Reverse - обратная) отличается противопо­ложностью рисунка G-окраске. Темноокрашенными здесь являются эухроматиновые участки хромосом, а светлыми - гетерохроматино­вые. Существует несколько модификаций метода R-окраски и каж­дый из них имеет свою кодировку по международной цитогенетичес­кой номенклатуре. Наиболее приемлемой является обработка пре­паратов Ва(ОН)₂ с прогреванием их при 60°С и последующей отмыв­кой в дистиллированной воде и окрашиванием раствором красителя Гимза. Кодировка R-окраски, полученной таким способом - RHG.

• С-окраска (от англ. Constitutive heterochromatin - конститутивный гетерохроматин) выявляется в виде вариабельных по величине темноокрашенных сегментов конститутивного гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, в то время как эухроматиновые учас­тки хромосом прокрашиваются очень бледно. Методы получения С-окраски могут варьировать, но важным условием является предварительная обработка препаратов щелочью с последующей двухча­совой инкубацией препарата в двукратном стандартном солевом растворе (2 X SSC) при 65°С. В качестве щелочных растворов обыч­но применяют гидрат окиси бария или натрия. Окраску препаратов производят красителем Гимза. С-окраска имеет свою кодировку (CBG) по международной цитогенетической номенклатуре. Конститутивный гетерохроматин построен преимущественно из многократно повто­ряющихся последовательностей ДНК, так называемой сателлитной ДНК, выявляемой во время градиентного центрифугирования хро­матина. В популяциях человека, также как и в случае Q-окрашивания, существует межиндивидуальная вариабельность по определен­ным участкам хромосом, в данном случае по величине блоков С-гетерохроматина, выявляемых с помощью С-окраски (С-полиморфизм хромосом). По локализации выделяют 4 типа С-хроматина: 1) соб­ственно центромерный, присущий всем хромосомам, с относитель­но небольшими по площади темноокрашенными блоками; 2) более крупные блоки гетерохроматина, располагающиеся в прицентромерных районах длинных плечей аутосом 1, 9 и 16, обладающие четко выраженным межиндивидуальным полиморфизмом; 3) большой блок гетерохроматина дистальной части длинного плеча Y-хромосомы, заметно варьирующий по величине у разных лиц мужского пола; 4) гетерохроматин коротких плеч акроцентрических хромосом. Метод выявления центромерного гетерохроматина позволяет, прежде все­го, оценить хромосомный полиморфизм четырех хромосом набора – 1, 9,16 и Y, а также используется в практике клинической цитогенетики для уточнения характера структурных перестроек затрагиваю­щих данные хромосомы. По международной цитогенетической но­менклатуре увеличенные или уменьшенные блоки гетерохроматина обозначаются как qh+ или qh- (h - гетерохроматин). Например, за­пись кариотипа 46,XX,9qh+ означает, что у нормальной женщины имеется вариант хромосомы 9 с большим гетерохроматиновым бло­ком в длинном плече, а запись 46,XYqh- означает, что у мужчины име­ется уменьшение длины гетерохроматинового блока на длинном пле­че Y-хромосомы.

• NOR-окраска (от англ. Nucleolar Organizer Region - Ядрышко-Образующие Районы – ЯОР) или Ag-окраска (серебрение) – приме­няется для выявления ядрышкообразующих районов, расположен­ных в коротких плечах (сегмент q12 - спутничная нить) всех 5 пар акроцентрических хромосом человека (13,14, 15, 21 и 22), с помощью окрашивания солями серебра. Известно, что районы ядрышковых организаторов содержат гены рибосомальной РНК (рРНК). Еди­ница транскрипции генов рРНК содержит гены 5,8S, 18S и 28S РНК. Ряды рРНК-транскрипционных единиц располагаются тандемно вдоль ДНК и отделяются друг от друга нетранскрибируемыми последова­тельностями – спейсерами. Транскрибируемый район и нетранскрибируемый спейсер тандемно повторяются примерно 40 раз в каждой из 5 пар акроцентрических хромосом, составляя около 400 копий ри-босомных генов на геном. В настоящее время для визуализации этих районов на метафазных хромосомах применяют метод серебрения Хоуэлла и Блэка (Howell, Black, 1980), основанный на использова­нии комбинации 50% раствора нитрата серебра с желатиновым про­явителем окраски в условиях прогревания препаратов при 60°С. С помощью этого метода сами хромосомы окрашиваются в желтый цвет, а в коротких плечах акроцентрических хромосом на спутничных ни­тях четко выделяются черные точечные образования - глыбки вос­становленного металлического серебра. Размеры этих глыбок, отра­жающие активность ЯОР, на разных хромосомах существенно варь­ируют - от отсутствия заметной окраски - до достаточно крупных блоков серебра (Ag-полиморфизм). Тонкие механизмы окраски яд­рышкообразующих районов хромосом пока неизвестны, но ясно, что красящим субстратом является не ДНК рибосомных генов и не рРНК, а кислые белки, связанные с ней. Для оценки данного типа хромо­сомного полиморфизма предложена полуколичественная 5-балль­ная система оценки активности ЯОР каждой из 5 пар акроцентри­ческих хромосом генома человека (0 - отсутствие окраски, 1 - сла­бая, 2 - средняя, 3 - сильная и 4 - очень сильная окраска ЯОР хро­мосом, при которой размеры Ag-блока значительно превышают тол­щину хроматид). При сложении баллов отдельных ЯОР может быть оценена активность всех 10 ЯОР генома по критерию суммарной функциональной активности ЯОР, предложенному Н.А. Ляпуновой с соавт. (1988). В популяциях человека существует межиндивидуаль­ный полиморфизм Ag-окрашенных хромосом, который выражается в специфичности степени окраски отдельных хромосом у разных ин­дивидов, являющейся наследуемой характеристикой.

• Т-окраска (от англ. Telomere -теломера) – применяется для вы­явления теломерных районов хромосом в коротких и длинных пле­чах. Метод включает инкубацию препаратов хромосом при 87°С в течение 20-60 минут в растворе фосфатного буфера при рН 5,1 с пос­ледующей окраской раствором красителя Гимза.