20. Модельные мембранные системы. Использование липосом для транспорта лекарственных веществ.
1. Модель – монослой липидов на границе раздела вода – воздух или вода – масло. Гидрофильные головки находятся в воде, а гидрофобные хвосты – в воздухе или в масле. Схема 1:
Если постепенно уменьшать площадь, занимающую монослоем, то удается получить монослои, в 2 молекулы расположены так же плотно, как и в одном из монослоев мембраны. При изменении состояния липидных молекул (под действием температуры, лекарственных препаратов) меняется площадь, занимаемая молекулами. Поэтому в биологических и медицинских исследованиях широко используются монослои синтетических липидов, изолированных из различных природных мембран.
2. Бислойная липидная мембрана – создана Мюллером в 1962г. Заполнили отверстие в тефлоновой перегородке, разделяющей 2 водных раствора, фосфолипидном, растворенным в гептане, Схема 2:
После того, как растворитель и излишки липида растекаются по тефлону, в отверстии образуется бислой толщиной несколько мм. и диаметром приблизительно 1мм, Схема 3:
Расположив по обе стороны мембраны 2 электрода, можно измерить сопротивление мембраны или генерируемый на ней потенциал. Если по разные стороны перегородки поместить различные по химическому составу растворы, то можно изучить проницаемость мембраны для различных агентов, а так же лекарственных препаратов.
3. Липосомы – это мельчайшие пузырьки (везикулы), состоящие из билипидной мембраны и полученные обработкой ультра звуком смеси воды и фосфолипидов малые одноламелярные везикулы. Липосомы фактически являются биологической мембранной, полностью лишенной белковых молекул, Схема 4:
В медицине Липосомы используют для доставки лекарственных веществ в однораздельные органы и ткани, приготавливая их в среде, содержащей нужное вещество. Липосомы не токсичны, полностью усваиваются в организме и являются надежной липидной микрокапсулой для направленной доставки лекарств. Обладают очень малой проницаемостью для ионов и большинства полярных молекул.
Большие многослойные Липосомы – липиды растворяют в органическом растворителе (бензол, хлороформ) и полученный раствор упаривают в вакууме в роторном испарителе. Липиды остаются на стенках колбы в виде пленки. В колбу с пленкой + водный буферный раствор и встряхивают его. Полученные Липосомы выдерживают в водной среде в течении нескольких часов для установления равновесия. Протеолипосомы = в результате + белка. + Интегральный белок:
+ белок – часть липосом разрушается с образованием липопротеиновых комплексов.
липопротеиновые комплексы адсорбируются на поверхности оставшихся интактными липосом.
липиды комплексов сливаются с липидами липосомальной мембраны.
Протеолипосомы встраиваются не во все клетки организма, а именно в те, которые нуждаются в лечении.
21. Электронная микроскопия в исследовании биологических мембран. Устройство электронного микроскопа. Метод замораживания – скалывания, замораживания – травления.
Электронный микроскоп. В основе работы электронного микроскопа лежит свойство неоднородных электрических и магнитных полей, обладает вращательной симметрией, оказывает на электронные пучки фокусирующее действие. Устройства, создающие поля, называемыми “’электронными линзами”. В зависимости от вида электронных линз:
1). Магнитные.
2). Электростатические.
3). Комбинированные.
По характеру исследования:
1). Просвечивающие.
2). Отражательные.
3). Эмиссионные.
4). Растровые.
5). Зеркальные.
Наиболее распространенным является электромагнитный микроскоп просвечивающего типа. Осветительная система (катод, фокусирующий электрод, анод) → камера объекта → фокусирующая система → блок регистрации конечного изображения. Объективная линза для получения увеличенного электронного изображения. Проекционная линза формирует конечное изображение. Максимальное увеличение микроскопа определяется величинами фокусных реакций объектива и проекцией линз и расстоянием между объектом наблюдения плоско конечного изображения.
Замораживание – травления – метод приготовления материала для электронной микроскопии, включает замораживание свежей или фиксированной ткани во фреоне или жидком азоте и изготовление срезов в условиях вакуума, при котором происходит частичная сублимация воды из ткани и на ее поверхности проступает рельеф. С такой правленой поверхности получают отпечатки и исследуют их под электронным микроскопом (3 – х. мерное изображение).
Замораживание – скалывание – включает в себя замораживание клеток при температуре жидкого азота ( - 196 C) и скалывание образовавшегося кубика льда. Открывающиеся поверхности сколов отмечают платиной и углеродом, органическое вещество удаляется и получатся платиновая решетка, которую рассматривают в электронный микроскоп.