Прилади та речовини для люмінесцентного аналізу

Метод люмінесцентного аналізу в медицині став більш успішно розроблятися з розвитком вивчення вторинної люмінесценції. Остання представляє світіння, що виникає після зафарбування тканин спеціальними барвниками – фото люмінофорами. Органічні фотолюмінофори, що випромінюють під дією ультрафіолетових чи променів видимої частини спектра, часто називають флуоресцентними барвниками, чи флуорохромами.

Флуоресцеїн (диоксифлуоран) (C20H12O5) – органічна сполука, барвник трифенілметанової групи, червоний кристалічний порошок, розчиняється в спирті, ефірі та водних лугах. Назва "флуоресцеїн" дано сполуці тому, що в лужних розчинах він має сильну флуоресценцію (у концентраціях до 1 : 2000000).

Отримують флуоресцеїн при нагріванні фталевого ангідриду з резорцином. У лужному середовищі оптимальна концентрація його 0,8 г/л, колір флуоресценції жовто-зелений, відносна яскравість 0,26 нт.

Флуоресцеїн майже нерозчинний у воді, тому для парентерального введення цього препарату застосовують його натрієву сіль.

Це один з найяскравіших флуорохромів. Енергетичний вихід світіння при кімнатній температурі у флуоресцеїну досягає 70-71%. Препарат нетоксичний і всебічно вивчений експериментаторами та клініцистами, допущений для застосування в клініці Міжнародною фармакопеєю, фармацевтами США, Великобританії та інших країн.

Однак, даючи повну й об'єктивну характеристику препарату, слід зазначити, що він має побічні ефекти, які часом небажані і вимагають своєчасного усунення. Нудота і блювання – найбільш часті ускладнення, що виникають при люмінесцентному дослідженні з флуоресцеїном, особливо при внутрішньовенному і внутршньоартеріальному введенні препарату. Однак вони легко знімаються зменшенням дози препарату, уповільненням швидкості введення його в судинне русло.

Стрімкий розвиток молекулярної біології та біотехнології потребує швидких і зручних методів детекції нуклеїнових кислот (НК) та білків. На заміну радіоактивним міткам, що традиційно застосовуються з цією метою, приходять ефективніші, зручніші, дешевші та безпечніші спектрально-люмінесцентні методи детекції. Це вимагає пошуку як нових барвників, придатних для цієї мети, так і методів їх ковалентної кон’югації з біомолекулами. Завдяки своїм унікальним спектрально-люмінесцентним властивостям ціанінові барвники є найчутливішими з нині існуючих флуоресцентних зондів для кількісного та якісного визначення НК. Молекулярні зонди, що містять ковалентно приєднану молекулу ціанінового барвника, успішно застосовуються для проведення полімеразної ланцюгової реакції, детекції НК в розчинах та гелях, для локалізації рецепторів у клітинах. Хоча реакція пірилоціанінів з амінами добре відома, систематичних досліджень взаємодії пірилоціанінів з біомолекулами не проводились. Майже всі функціональні групи, які здатні реагувати з аміногрупою, широко застосовуються в біоогранічній хімії для кон’югації.

Апаратура для люмінесцентних досліджень повинна бути портативною, зручною, забезпечувати проведення діагностичних спостережень у будь-яких умовах, мати оптико-світлотехнічну систему для концентрації випромінювання на визначену ділянку.

1. к варцова лампа;

2. діафрагма;

3. заслінка;

4. фільтр;

5. кварцова оптика;

6. посудина з досліджуваним розчином;

7. кварцова оптика;

8. світлофільтри;

9. фотоелементи.

Рис. 4. Схема лабораторного флуориметра ЄФ-3М.

Основними вузлами апарату­ри для люмінесцентного аналізу є освітлювач із світлофільтрами, кю­вети, діафрагми і пристрій для вимірювання інтенсивності свічення. Освітлювачем для люмінесцентного аналізу, як правило, використову­ють ртутні лампи. Приймачем виступає фотоелемент або фото помножувач. Принципова схема лабораторного флуориметра ЄФ-ЗМ, призначеного для кількісного аналізу вітамінів та інших люмінесціюючих речовин, показана на рис. 4.

Світло від кварцової лампи 1, проходячи через діафрагму 2, світлофільтр 4 і кварцову оптику 5, потрапляє на посудину з досліджува­ним розчином. Люмінесцентне свічення досліджуваного розчину прохо­дить через кварцову оптику 7, вторинні світлофільтри 8, потрапляє на фотоелемент 9. Фотоелемент, перетворюючи світлову енергію в еле­ктричну, подає її на електронний підсилювач, в анодний ланцюг якого підключений мікроамперметр. Покази мікроамперметра прямо пропорцій­ні концентрації люмінесціюючої речовини.

Спочатку результати люмінесцентних досліджень оцінювалися лише візуально і за допомогою фотографування.

Надалі застосовували лабораторний фотометр, а також сконструювали спеціальну апаратуру для графічної реєстрації люмінесценції. При цьому стали одержувати більш точні дані, хоча метод дослідження ускладнився. Разом з тим там, де необхідно оцінити поводження різних флуорохромів у патологічній тканині, доцільно застосовувати саме цей метод.

У практичній роботі користалися візуальним лабораторним фотометром моделі ВФМ-57. Прилад дозволяє проводити вимірювання в області малих яскравостей, причому як білих, так і кольорових поверхонь. Межі виміру малих яскравостей приладу від 5-10 до -0,00003 нт. Верхня межа виміру високих яскравостей до 1 · 106 нт у "кольоровому" світлі і до 5 · 106 нт у "білому" світлі.

Погрішність виміру залежить від яскравості і кольору вимірюваної поверхні та умов виміру і складає: у "білому" світлі 1:5 %; у "кольоровому" світлі 2:10%.

Принцип дії приладу заснований на візуальному порівнянні яскравості двох фотометричних полів, з яких одне - вимірюване, інше - поле порівняння. Для реєстрації яскравості кольорових поверхонь до приладу додається набір з дев'яти кольорових світлофільтрів. Основні вузли фотометра малих яскравостей- вимірювальна голівка, стійка, яка живить пристрій. Крім того, у комплект приладу входять також спеціальні насадки і пристосування. Методика роботи з фотометром проста.

Слід зазначити, що при фотометруванні прагнули до того, щоб зникли границі фотометричного поля. Коли порівнюють різнобарвні поля, то прагнуть до того, щоб вони залишалися різнобарвними, але були однаковими по яскравості. При фотометруванні високих яскравостей доцільно порівнювати середнє кільце фотометричного поля не з зовнішнім, як це рекомендується при вимірі малих яскравостей, а з центральним кружком.

Для фотоелектричного фотометрування сконструювали апаратуру для графічного запису процесу фотоелектричного фотометрування. Змонтована на базі ФЗУ-54 з режимом живлення 1800 В, вона дозволяє проводити дослідження на рівні мікроциркуляції і записувати у виді графічних кривих картину світіння, що спостерігається.

Прилад складається з фіброволоконного світловоду, світлочутливого елементу (ФЭУ-54), джерела живлення й одноканального элекфокардиографа ЭКСПЧТ-4 чи самописи Н-390.

Так як прилад виготовлений за схемою підсилювача постійного току, то в ньому сигнал був поданий на передвихідний каскад для того, щоб простежити повільні зміни сигналу, що знімається з навантаження ФЭУ. Прилад реєструє картину світіння, що спостерігається, у мікроамперах і здійснює лінійний запис за допомогою електрокардіографа чи самописа Н-390.

Для вивчення люмінесцентного світіння порожнистих органів користалися також ПТУ. Цей прилад зібраний на базі прикладної телевізійної установки ПТУ-32: використана телевізійна камера КТП-40. У її склад входять телевізор, телевізійний осциллограф СІ-57 і джерело живлення з напругою 0-20 В. В установці застосовуються два світловода (фіброволоконна оптика), один з них звернений до об'єкту, на другий ж падає світло від лампи розжарювання, напруга якої міняється від 0 до 20 В. Результати світіння реєструвалися фотоелектронною установкою.

Аналізатори типу «Флюорат» є прикладом доступної лабораторної апаратури, що реалізує можливість фотолюмінісцентних та хемілюмінесцентних вимірювань. Застосовані в них імпульсні плазмові джерела світла забезпечують високу чутливість, широкий спектральний діапазон та можливість кінетичних вимірювань в часових інтервалах до 105-106 секунд. Крім того, ці прилади дозволяють легко реєструвати люмінесценцію при низьких температурах (77 К), а також можуть використовуватися як флуоресцентний детектор в рідинній хроматографії. Автоматичні процесні аналізатори типу «Флюорат-А», поєднують проточно-інжекційні та проточно-екстракції методи з люмінесцентним детектуванням.