Оформлення результатів:

Студент в протоколі фіксує результати дослідів та робить висновки щодо механізмів реакції. В кінці заняття студент показує результати викладачу.

Література

4. Пищевая химия. Нечаєв А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др.. Под ред. А.П. Нечаєва. Издание 4-е, испр. и доп. – СПб.: ГИРД, 2007. – С. 17-121.

5. Дуденко Н.В., Павлоцкая Л.Ф., Кривоносов М.В., Кратенко Р.Н. Биологическая химия. – Харьков: Прапор, 1999. –– С.22-25.

6. Павлоцька Л.Ф., Дуденко Н.В., Дмітриєвич Л.Р. Основи фізіології гігієни харчування та проблеми безпеки харчових продуктів. Суми:ВТД «Університетська книга», 2007. – С. 21-27

Пасальський Б.К. Хімія харчових продуктів: Навчальний посібник. – К.: Київ. Держ. торг.-екон.ун-т, 2000. – С.121-140.

Лабораторна робота №3 Якісний та кількісний аналіз препарату Хімотрипсин (Початок)

Мета роботи: перевірити препарат Хімотрипсин згідно показників, наведених в аналітичному нормативному документі лікарський засіб

Матеріали та обладнання: лікарський препарат Хімотрипсин; мікроскопи; предметні та накривні скельця; бактеріологічні петлі; спиртівки; крапельниці з дистильованою водою; барвники (метиленовий синій, розчин Люголя); чашки Петрі з поживними середовищами МПА, ГКА та Ендо.

Основні відомості

Хімотрипсин – це протеолітичний фермент, який отримують при культивування рекомбінантного штаму E. coli. Він розщеплює пептидні зв’язки в молекулі білка, що, утворені залишками ароматичних амінокислот, забезпечуючи протизапальний ефект. Лізує некротовані тканини, не впливаючи на живі клітини внаслідок наявності в них специфічних антиферментів. Даний препарат повинен повністю відповідати вимогам, зазначеним у АНД. До показників, які контролюються в даному препараті ,відновиться протеолітична активність та мікробіологічна чистота.

Визначення протеолітичної активності (ПС)

(модифікований метод Ансона)

Основою визначення є широко відомий метод Ансона, заснований на визначенні тирозину, який утворився в результаті ферментативного гідролізу білка, з реактивом Фоліна.

Після дії дослідного ферментного препарату на розчин казеїну білок, що не розклався, осаджують 5 %-ою трихлороцтовою кислотою (ТХО) і у фільтраті за допомогою колориметричної реакції з реактивом Фоліна визначають кількість гідролізованого білка, який не осаджується ТХО. Беруть кількість розщепленого білка, пропорційну кількості тирозину, що міститься у фільтраті.

Одержані значення оптичної густини переводять у мікромолі тирозину за стандартною кривою, побудованою за чистим тирозином. За одиницю ПС взято таку кількість ферменту, яка каталізує перехід у неосаджуваний ТХО стан кількість білка, яка містить 1 мікромоль тирозину, за 1 хв при температурі 30 ^оС.

Протеолітичну активність препаратів виражають числом одиниць в 1 г препарату, а розчинів ферментів числом одиниць в 1 мл розчину.

Техніка визначення:

Для визначення протеолітичної активності у дві пробірки (заввишки 18 см і діаметром 2 см) наливають по 2 мл розчину казеїну і вміщують в ультратермостат з температурою 30 ^оС. Приблизно через 10 хв, коли температура розчину у пробірці буде 30 ^оС, у кожну з них додають по 2 мл розчину ферменту, струшують і вміщують в ультратермостат для гідролізу на 10 хв. Через 10 хв у обидві пробірки додають по 4 мл 5% ТХО, щоб перервати ферментативну реакцію і осадити білки та високомолекулярні продукти гідролізу. Суміш швидко перемішують і для забезпечення повного осадження витримують при температурі 30 ^оС ще 20 хв. Потім фільтрують через паперовий фільтр на маленьких воронках у сухі пробірки. Із прозорих фільтратів відбирають у пробірки по 1 мл, додають по 5 мл 0,5 М розчину Na₂CO₃, перемішують і при безперервному перемішуванні швидко додають по 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна. Дають реакційній суміші постояти 20 хв. Розчини набувають блакитного забарвлення, інтенсивність якого визначають на фотоелектроколориметрі.

Глухий дослід (контроль) готують, додаючи реагенти у зворотному порядку: до 2 мл ферментного розчину того самого розведення, що і в досліді, додають 4 мл ТХО, витримують в ультратермостаті 10хв, а потім вносять 2 мл субстрату.

Через 20 хв витримування в термостаті розчин фільтрують, відбирають у суху пробірку 1 мл фільтрату, а потім при перемішуванні вносять 5 мл 0,5 М Na₂CO₃ та 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна. Контрольна проба повинна мати слабке блакитне забарвлення.

Колориметрування здійснюють на ФЕК з червоним світлофільтром (довжина хвилі 670 нм) в кюветах завтовшки 10 мм. Спочатку визначають поглинання контролю проти води D_k, а потім поглинання дослідного розчину проти води D₀. Дійсне поглинання розчину становить D₀ – D_k. Для забезпечення достоменності аналізу поглинання розчину має бути в межах 0,3...0,6. У розрахунках використовують середнє значення, одержане із двох паралельних визначень.