Техніка визначення

У дві пробірки заввишки 20 см і діаметром 2 см наливають по 5 мл субстрату і витримують при температурі 40 ºС в ультратермостаті протягом 10 хв для досягнення розчином зазначеної температури.

Потім у першу пробірку додають 2,5 мл дистильованої води (контроль), а в другу – 2,5 мл досліджуваного ферментного розчину (дослід). Пробірки ставлять у термостат з температурою 40 ºС на 1 год.

Після закінчення гідролізу в кожну пробірку додають по 5 мл 0,3 М розчину ТХО, щоб припинити ферментативну реакцію та осадити непрогідролізований казеїн. Суміш швидко перемішують і для більш повного осадження витримують 15 хв при температурі 40 ºС в термостаті. Потім розчини фільтрують через паперові фільтри і у фільтраті визначають кількість прогідролізованого білка за тирозином.

Для цього по 2 мл фільтрату наливають у широкі пробірки, повільно приливають у кожну по 5 мл 0,5 М розчину вуглекислого натрію та по 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна, безперервно перемішуючи, витримують в ультратермостаті при температурі 40 ºС для розвитку забарвлення 30 хв, а потім фотометрують на ФЕК з довжиною хвилі 656–677 нм при використанні кювет 5 мм. Оптичну густину розчинів вимірюють по відношенню до контрольної проби.

Розрахунок проводять за формулою, виведеною для визначення протеолітичної активності бактеріальних ферментних препаратів:

, од/г або од/мл,

де 4,7 і 0,1 – постійні коефіцієнти, отримані експериментально; D – оптична густина досліджуваного розчину; n – кількість ферментного препарату в 2 мл реакційної суміші, мг; 1000 – перерахунок на 1 г препарату.

Приклад розрахунку. На аналіз взято 0,1 г ферментного препарату, розчинено в 100 мл дистильованої води. Із цього розчину зроблено розведення – 5 мл до 100 мл, на протеоліз відібрано 2,5 мл. Після додавання ТХО об’єм реакційної суміші дорівнює 12,5 мл. На визначення тирозину взято 2 мл і отримано оптичну густину 0,193.

Тоді кількість ферментного препарату в 2 мл фільтрату буде дорівнювати:

Реактиви:

1. Розчин казеїну 1%-й. Для його приготування 2 г (порошку) і вносять у конічну колбу на 300 мл і приливають 140 мл карбонатно-гідрокарбонатного буфера рН 10,7. Колбу ставлять на магнітну мішалку і розчин перемішують протягом 30 хв. Потім, продовжуючи перемішування, колбу з субстратом вміщують у водяну баню з температурою 70 ºС до повного розчинення, охолоджують до 40 ºС і при цій температурі доводять рН до 10,5, додаючи 1 М розчин їдкого натрію.

Розчин казеїну кількісно переносять у мірну колбу на 200 мл і додають карбонатно-гідрокарбонатний буфер до об’єму 180 мл. Потім розчин казеїну охолоджують проточною водою до температури 20 ºС і об’єм субстрату доводять до 200 мл тим самим буфером. Розчин зберігають у холодильнику не більше 3 діб.

2. 0,2 М карбонатно-гідрокарбонатний буфер. Готують його змішуванням у мірній колбі на 200 мл розчин А – 45 мл, розчину Б – 5 мл, об’єм доводять до мітки дистильованою водою.

Розчин А – 0,2 М розчин карбонату натрію. Для його приготування розчиняють 21,2 г карбонату натрію в дистильованій воді, об’єм доводять до 1 л.

Розчин Б – 0,2 М розчин гідрокарбонату натрію. Для його приготування розчиняють 16,8 г гідрокарбонату натрію в дистильованій воді, об’єм доводять до 1 л.

3. 1 н розчин їдкого натрію. Для його приготування 40 г їдкого натрію розчиняють у дистильованій воді, об’єм доводять до 1 л.

4, 5, 6 – 0,3 М розчин трихлороцтової кислоти (ТХО); 0,5 М розчин вуглекислого натрію та реактив Фоліна.

7. Робочий реактив Фоліна. Готують розведенням основного розчину безпосередньо перед аналізом у співвідношенні 1:3.

Перевірка мікробіологічної чистоти (початок)

Для визначення наявності мікроорганізмів у препараті необхідно відкрити ампулу за допомогою ампульного ножа. До вмісту ампули необхідно додати 5 мл стерильної водопровідної води та обережно перемішати до повного розчинення вмісту ампули.

На щільні поживні середовища МПА, ГКА та Ендо наноситься 0,1 мл розчину препарату. Препарат розтирається по поверхні середовища шпателем Дригальського.

Чашки Петрі зі зразками переносяться в термостати з відповідними температурами для подальшого культивування. Культивування мікроорганізмів на МПА та Ендо здійснюється при температурі 35-37 ºС, а на ГКА – 27-30 ºС.

Підрахунок колоній мікроорганізмів проводять на наступному занятті.