Химически структурированные модели кинетики образования продуктов жизнедеятельности клеток

В сравнении с изучением кинетики роста индивидуальной клетки и популяций клеток в проблеме кинетики процессов образования продуктов метаболизма разработке структурированных моделей посвящено относительно небольшое число работ. Можно ожидать, однако, что развитие структурированных моделей клеточного роста в ближайшем будущем потребует разработки ряда таких моделей. В этом разделе мы рассмотрим интересный процесс образования одного из множества вторичных метаболитов, на примере которого познакомимся с рядом важных аспектов процессов микробиологического синтеза антибиотиков, а также с новыми подходами к моделированию кинетики таких процессов.

Синтез ряда микробных антибиотиков и других продуктов вторичного метаболизма ингибируется высокими концентрациями фосфатного иона. Поскольку для роста клеток фосфат совершенно необходим, очевидно, должен существовать некоторый оптимальный уровень его концентрации. Действительно, такой оптимальный уровень начальной концентрации фосфата наблюдался, например, при биосинтезе алкалоидов Claviseps purpurea (рис. 7.32).

Приведенные на рис. 7.32 экспериментальные данные хорошо моделируются следующими уравнениями кинетики клеточного роста периодической культуры и образования продукта жизнедеятельности [26]. Рост клеток:

к.

В результате лизиса фосфат выделяется в среду; как показывает второе слагаемое правой части уравнения (7.95), его количество пропорционально содержанию фосфата в клеточной массе Ур/х и внутриклеточной концентрации фосфата р_i. Первое слагаемое той же части того же уравнения описывает активнын транспорт фосфата в клетку; кинетика этого процесса характеризуется наличием режима насыщения. Уравнение материального баланса по внутриклеточному фосфату [уравнение (7.96)] является вариантом уравнения (7.67); здесь учтено, что скорость его образования равна разности между скоростью транспорта фосфата в клетку и скоростью включения фосфата в компоненты клетки. В уравнении скорости образования продуктов принято во внимание ингибирование процесса фосфатом в том виде, в каком этот эффект учитывался ранее при моделировании репрессии фермента фосфатазы.

Сплошные кривые на рис. 7.32 были вычислены с помощью описанной модели, а значения соответствующих параметров перечислены в табл. 7.5. Эта структурированная модель хорошо отражает закономерности изменения биомассы и массы алкалоидов во времени, в том числе наличие максимума на кривой накопления суммы алкалоидов, но в то же время при высоких концентрациях фосфата ее точность недостаточно высока. С помощью такой модели, в частности, было показано, что максимальное количество суммы алкалоидов продуцируется при начальной концентрации фосфата в среде 0,17 г/л. Математическое моделирование различных методик введения фосфата (в том числе добавления фосфата по частям в различные фазы процесса) показало, что таким путем нельзя добиться существенного повышения выхода алкалоидов по сравнению с обычным периодическим процессом при оптимальной начальной концентрации фосфата в среде. В других случаях, которые мы рассмотрим в последующих главах, периодические процессы с добавлением субстрата оказываются очень полезными.

Моделирование кинетики образования продуктов метаболизма на основе механизмов молекулярных превращений; генетически структурированные модели

Чем точнее описание кинетики в модели отражает действительно осуществляющиеся в клетке химические события, тем более универсальной становится наша модель. Здесь под «универсальностью» мы понимаем возможность получения удовлет­ворительных результатов в условиях, отличающихся от используемых в ходе разработки модели и определения ее параметров. Механизмы белкового синтеза, имеющего большое значение в производстве ферментов, гормонов и других практически важных полипептидов, изучены настолько глубоко, что становится возможной разработка моделей на уровне молекулярных событий и взаимодействий. Подобные модели должны быть в высшей степени универсальными и полезными в оптимизации параметров среды и генетической природы организма.

Материальный баланс по мРНК, образующейся при транскрипции данного гена G, можно выразить следующим уравнением (здесь квадратные скобки служат для обозначения молярных концентраций данного компонента в клетке, выраженных в молях в единице объема клетки) Г271:

В этом уравнении k_p — константа общей скорости транскрипции, a k_d—константа скорости инактивации и(или) деструкции мРНК; допускается, что оба последних процесса имеют первый порядок. В уравнении (7.98) учтен также коэффициент эффективности утилизации промотора ц, отражающий модуляцию транскрипции оператором. Во многих случаях, представляющих практический интерес, оценка ц в единицах концентраций белка-эффектора и индуктора или репрессора является наиболее важным этапом всего моделирования.

Аналогично можно записать и уравнение материального баланса по внутриклеточному продукту трансляции, т. е. по исследуемому белку:

Здесь скорость синтеза белка пропорциональна концентрации кодирующей данный белок мРНК и эффективности ее утилизации на рибосомах (можно достаточно обоснованно предположить, например, что изменение нуклеотидной последовательности в связывающем рибосому центре приведет к изменению величины I). В этом случае мы опять принимаем, что реакция инактивации белка имеет первый порядок.

В табл. 7.6 приведены характерные средние значения параметров описанной модели для синтеза белка в Е. coli, отражающие найденные зависимости параметров скоростей транскрипции и трансляции от скорости роста.

Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют о том, что во многих случаях скорость экспрессии генов в Е coli лимитируется стадией транскрипции. Следовательно, скорость экспрессии регулируемого оператором гена зависит от эффективности транскрипции этого гена, которая в свою очередь определяется совместным влиянием модулирующих агентов на сайты оператора и связывания РНК-полимеразы. В качестве примера рассмотрим систему промотор-оператор гена lac Е. coli, причем основное внимание будем уделять совместному влиянию lас-репрессора, индуктора и ДНК на экспрессию гена и, следовательно, на β-галактозидазную активность [28].

Так, ее параметры имеют строгое физико-химическое толкование и часто могут быть определены в отдельных экспериментах in vitro. Более того, модель такого уровня обладает особой характеристикой, называемой генетической структурой. Под генетической структурой в данном случае понимается четкая зависимость определенных параметров модели от генетической природы; так, изменение нуклеотидной последовательности lас-оператора должно сопровождаться изменением параметров Ка и Ко, характеризующих взаимодействия /ас-оператора с белком-репрессором. По мере развития и углубления наших знаний о механизмах взаимодействий в системе ДНК—белок, вероятно, мы сможем учитывать влияние опреде­ленных изменений нуклеотидной последовательности на соответствующие константы связывания ДНК с белком расчетным путем. Тогда разработанная на молекулярном уровне кинетическая модель позволит осуществлять картирование нуклеотидной последовательности, отражающее продуктивность популяции клеток. Потенциальные возможности такого подхода для рациональной количественной оптимизации генетической модификации организма (или, по меньшей мере, клонированных, участков ДНК) очевидны.

В качестве примера рассмотрим применение уравнения (7.106) для расчета влияния концентрации репрессора на скорости индуцированной и неиндуцированной транскрипции /ас-промотора-оператора хромосомы Е. coli. Необходимые экспериментальные данные, в том числе внутриклеточные концентрации репрессора для каждого из мутантов, известны для мутантных штаммов i^-, i^q и i^sq Е. coli. Эти величины можно непосредственно использовать при моделировании; они не влияют на другие параметры модели. Как показано в табл 7.7, модель удовлетворительно отражает влияние внутриклеточной: концентрации репрессора как в присутствии индуктора, так и. без индуктора. В приведенной в конце главы литературе можно^ найти другие примеры моделирования с учетом регуляции на молекулярном уровне.