Санитарно-бактериологическое исследование почвы, воды и воздуха

Микробы широко распространены в природе и являются наиболее постоянными обитателями почвы, воды, воздуха, растений, животных, человека. Они находятся на различных предметах, в пищевых продуктах и других объектах.

При лабораторной диагностике инфекционных болезней исследуют материал от больных людей, а также лиц, на­ходившихся в контакте с ними, и объекты внешней среды. При этом устанавливают источник и пути распространения микроорганизмов. Так, при диагностике кишечных заболе­ваний, пищевых отравлений параллельно с исследованием испражнений и мочи от больных исследуют пищевые про­дукты и воду.

При лабораторном исследовании почвы, воды, воздуха, как и при исследовании любого объекта, должна быть из­вестна цель исследования, которая определяет выбор мето­дики. Не менее важным является строгое соблюдение пра­вил отбора проб.

Исследование почвы. С этой целью выбирают наиболее характерные для данной местности участки площадью 25 м². Пробы отбирают из разных мест участка по диагонали или

94

по углам и в центре на глубине 10—20 см по 100—200 г та­ким образом, чтобы общий вес пробы составлял 0,5—1 кг. После тщательного смешивания берут среднюю пробу весом 100—200 г. Для взятия проб из глубоких слоев почвы поль­зуются специальным буром с полостью. На заданной глу­бине полость бура открывается, наполняется почвой, меха­нически закрывается, после чего бур извлекают. Образцы почвы помещают в стерильные банки, нумеруют и достав­ляют в лабораторию. Почву для посева растирают в сте­рильных ступках, последовательно (серийно) разводят в изотоническом растворе хлористого натрия 1 : 10, 1 :100, 1 : 1000 и т. д. и в количестве 0,1—1 мл засевают в специаль­ные питательные среды в аэробные и анаэробные условия^. В зависимости от поставленной задачи производят общий подсчет выросших микробов, изучают характер микрофло­ры и выделяют определенные патогенные виды микробов.

Капиллярная микроскопия используется для выявления микробов, ко­торые не культивируются на общеизвестных средах. В почву или водое­мы помещают очень тонкие капилляры, через которые сравнительно лег­ко проникают микроорганизмы. Изучение их производят с помощью осо­бых методов, применяемых в лабораториях общей микробиологии.

Почва является резервуаром бацилл сибирской язвы, кло-стридий столбняка, газовой анаэробной инфекции, кишечной палочки и др. Источником их служат фекалии человека и животных. Выявление степени инфицирования почвы пато­генными бациллами, клостридиями и бактериями имеет большое эпидемиологическое значение. Методика выделения чистой культуры анаэробов описана на стр.⁴80.

Исследование воды. Санитарно-бактериологическое иссле­дование воды включает определение общего числа микробов в 1 мл воды, определение коли-титра или коли-индекса, в от­дельных случаях (при эпидемиологических показаниях) об­наружение патогенных микробов, их токсинов и фагов.

Е. coli являются обычными обитателями кишечника и выделяются в большом количестве с фекалиями во внешнюю среду. Выявление Е. coli в воде свидетельствует о фекаль­ном загрязнении.

Существуют количественные показатели фекального за­грязнения: коли-титр и коли-индекс. Коли-титром называет­ся то наименьшее количество жидкости в миллилитрах или сухих веществ в граммах, в котором содержатся Е. coli. Коли-индексом называется то количество кишечных палочек, которое находится в 1 л или 1 кг исследуемого материала.

95

Важной частью исследования является взятие проб воды. Это может быть доверено только специально подготовлен­ным лицам (санитарный врач или помощник санитарного врача). Пробы воды для исследования берут в полулитровые бутылки, стерилизованные в печи Пастера при 160° в тече­ние П/2 часов или 20 минут в автоклаве при 120°.

При взятии проб из водопроводных кранов, насосов, труб последние предварительно обжигают пламенем ватного тампона, смоченного спиртом, затем спускают воду в те­чение 10 минут, чтобы смыть бактерии, проникшие в верх­ние части труб. В открытых водоемах воду для исследова­ния берут с помощью батометра. Этот прибор представляет собой металлический каркас, внутри которого устанавли­вается стерильная бутылка. Батометр имеет приспособление, позволяющее отобрать пробу на любой глубине. Обычно берут воду на глубине 15 см, при малой глубине водоема — не ближе 10—15 см ото дна. Бутылки с пробами воды долж­ны иметь этикетки, где обозначают место взятия пробы, да­ту и время (день, час), фамилию лица, взявшего пробу, а также цель исследования.

Воду доставляют в лабораторию тотчас после ее взятия. Транспортировка должна занимать не более 2 часов. В ис­ключительных случаях ее можно исследовать позже, одна­ко по истечении 6 часов с момента взятия вода не подлежит бактериологическому исследованию, так как количество микробов в ней изменяется, причем может быть как уве­личение, так и уменьшение их числа. Особое значение это имеет для хлорированной воды, поэтому ее отбирают в бу­тылки с 2 мл 1,5% раствора гипосульфита натрия (Na₂S20₃ • 5Н₂0). Такое количество сульфита связывает хлор при его концентрации до 2 мг/л в объеме 500 мл. Ле­том транспортируют воду во льду, а зимой в грелках (тем­пература поддерживается в пределах 1—5°). После доставки проб в лабораторию приступают к исследованию, которое включает определение общего количества микробов и опре­деление коли-титра или коли-индекса.

Определение общего числа микробов. Во­допроводную воду, а также воду открытых водоемов сеют в количестве 1 мл после предварительного разведения. Для этого наливают в ряд пробирок по 9 мл стерильной воды, в первую пробирку вносят 1 мл исследуемой воды, из этой пробирки после тщательного перемешивания переносят 1 мл во вторую и далее во все последующие пробирки по 1 мл предыдущего разведения. Таким образом, разводят воду

96

1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000 и т. д. Обычно сеют Не Менее двух разведений. Каждое из них рекомендуют сеять в 2 чашки. 1 мл исследуемой воды наносят каплями на дно чашки Пет­ри и заливают расплавленным, остуженным до 45° мясо-пеп­тонным агаром (рН 7,2—7,4) и осторожно смешивают, не смачивая крышки. После застывания агара чашки помеща­ют в термостат при 37°.

Посев воды следует производить с таким расчетом, что­бы на чашках образовалось не менее 30 и не более 300 ко-

Рис. 55. Счетная камера Вольфюгеля.

лоний. Эти результаты считают достоверными, т. е. количе­ство колоний соответствует количеству микробов, находя­щихся в воде. При исследовании воды с небольшим количеством микробов результаты считают правильными и в том случае, если при посеве 1 мл насчитывают менее 30 ко­лоний.

Через сутки подсчитывают число колоний, пользуясь лу­пой, увеличивающей в 5 раз. Если колоний оказалось более 300 и больших разведений нет, а анализ повторить нельзя, пользуются счетной камерой Вольфюгеля (рис. 55). В каме­ре отграничены площади, равные 1 см². Чашку устанавли­вают под стекло камеры. Сосчитывают количество колоний в 20 см², делят на 20 и умножают на 78,5 (площадь чашки Петри). Количество микробов в 1 мл воды определяют, учи­тывая разведения при посеве. Например, в чашке с посевом 1 мл воды, разведенной 1 : 100, сосчитано 120 колоний, сле­довательно, количество микробов в 1 мл исследуемой воды будет составлять 120Х 100= 12 000.

Водопроводная вода согласно требованиям, изложенным в ГОСТ 2874-54, должна содержать не более 100 микробов в 1 мл. Микробное число в воде колодцев и открытых водое­мов не должно превышать 1000.

97

При определении коли-титра и коли-индек-са воды учитывается способность Е. coli человека и жи­вотных развиваться в условиях температуры 43°, расщеплять глюкозу с образованием газа, вызывать пожелтение и обра­зование газа в розоловом агаре. Исследование воды с целью определения коли-титра или коли-индекса производится в течение 2 дней.

Первый этап. 1 мл исследуемой воды сеют в обычную сре­ду Эйкмана— глюкозо-пептонную среду, которая состоит из 1000 мл воды, 10 г пептона, 5 г NaCl и 5 г глюкозы. Большие объемы воды сеют в концентрированную среду Эйкмана (1000 мл среды содержат 100 г пептона, 50 г NaCl и 50 г глюкозы). Концентрированную среду разводят ис­следуемой водой в 10 раз: 100 мл воды сеют в 10 мл среды, 10 мл воды — в 1 мл среды.

Водопроводную воду большинства городов и населенных пунктов сеют в объеме 300 мл: 2 объема по 100 мл и 10 объе­мов по 10 мл. Водопроводную воду городов с населением больше миллиона сеют по 100 мл 4 объема и 10 объемов по 10 мл, всего 500 мл.

При исследовании воды чистых открытых водоемов для посева используют 100; 10; 1 и 0,1 мл (1 мл воды, разве­денной 1 : 10); если вода загрязнена — 10; 1 и по 1 мл воды, разведенной 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000 и т. д., в зави­симости от предполагаемого загрязнения.

Посевы помещают в термостат при 43°. Е. coli человека и животных быстро развиваются в этих условиях, тогда как размножение кишечных палочек холоднокровных животных и микробов — сапрофитов задерживается.

Второй этап. Через 7—12 часов посевы извлекают из тер­мостата, из всех пробирок и флаконов, независимо от на­личия признаков роста, делают пересевы в розоловый диа­гностический агар (уколом и по скошенной поверхности штрихами). Глюкозо-пептонную среду вновь помещают в термостат при 43°.

Приготовление розоловой среды. К 1 л мясо-пептонно-го агара (рН 7,4—7,6) добавляют 50 мл желчи, 10 г лактозы, 1 г глюко­зы, 2 мл 1% спиртового раствора индикатора бромтимолового синего и 2 мл 5% спиртового раствора розоловой кислоты, среду разливают до ¹U высоты пробирки и стерилизуют в автоклаве под давлением 0,5 атм. в течение 10 минут. Перед употреблением среду расплавляют и слегка наклоняют пробирки, чтобы после застывания она имела форму столбика и скошенную поверхность.

После 12—17 часов инкубации при 37° учитывают ре­зультаты посева в розоловом агаре. Кишечная палочка вы-'

98

зывает пожелтение среды, появление разрывов, вспенивание i-.ондснсационной жидкости. На скошенной поверхности ко-лонии имеют желтый цвет. В глюкозо-пептонной среде через М часа при наличии кишечной палочки наблюдается газо-поразование и помутнение. Следовательно, газообразование II изменение цвета розолового агара, а также помутнение и I ;i юобразование в глюкозо-пептонной среде свидетельствует О присутствии кишечных палочек в данном образце воды. !тот способ дает возможность обнаружить Е. coli через 24 часа, однако он не всегда точен. Более достоверным яв­ляется выделение чистой культуры и идентификация ее. В чтом случае, кроме обычного «пестрого» ряда, применяют тесты, которые дают возможность дифференцировать Е. coli, Aorobacter aerogenes и Escherichia intermedia. Для этой цели определяется способность усваивать соли лимонной кис­лоты, ставится реакция на образование ацетилметилкарби-цола и реакция с индикатором метиловым красным.

Полное исследование является громоздким и требует большой затраты времени (5—6 суток), однако оно дает возможность установить недавнее загрязнение воды (об­наружение Е. coli) и давнее фекальное загрязнение (об­наружение Е. intermedia и Aerobacter aerogenes).

После выявления Е. coli в определенных объемах воды ус­танавливают коли-титр и коли-индекс при помощи специ­альных таблиц, которые прилагаются к инструкции (ГОСТ 5216-50). Если при исследовании водопроводной воды ус­тановлено присутствие Е. coli в одном объеме 100 мл и двух объемах по 10 мл, то согласно схеме исследования воды ко­ли-титр равен 77, а коли-индекс 13. Такие показатели недо­пустимы для доброкачественной водопроводной воды. Со­гласно ГОСТ 2874-54 коли-титр водопроводной воды дол­жен быть не менее 300.

Ниже приводятся схемы исследования воды, артскважин, водопроводов и открытых водоемов (табл. 1 и 2).

Ускоренный метод определения коли-титра и ко-лн-индекса при помощи мембранных фильтров был предло­жен в 1932 г. сотрудниками Рублевской водопроводной стан­ции. Мембранные фильтры изготовляются из нитроцеллю-лозных пленок. Выпускаются 5 номеров фильтров: чем меньше номер, тем меньше величина пор. Для исследования поды используются фильтры № 3. Они имеют поры разме­ром 0,7 р/и фильтруют 500 мл воды в течение 2¹/₂ минут.

Непосредственно перед фильтрованием мембранный фильтр кипятят в течение 10—15 минут в дистиллированной

99

воде (до кипячения отмечают графитным карандашом точки НА блестящей поверхности), затем обжигают спиртом ворон­ку н столик с сеткой прибора для фильтрования и помещают на сетку фильтр блестящей поверхностью вниз. Воронку и фильтр закрепляют специальным приспособлением, нали-|-нот исследуемую воду и фильтруют при небольшом ваку-\мс в приемном сосуде. После фильтрования нитроцеллю-

лозную пленку переносят стерильным пинцетом на чашку со средой Эндо и кладут блестящей поверхностью вниз так, чтобы между ею и питательной средой не было пузырьков воздуха. На одну чашку можно поместить 4 фильтра. Через сутки инкубации в термостате при 37° на пленке появляют­ся типичные колонии Е. coli (рис. 56) темно-красного цвета с металлическим блеском. Из этих колоний делают мазки. И случае обнаружения грамотрицательных бактерий остав­шуюся часть колоний пересевают в глюкозо-пептонную Среду, которую помещают в термостат при 43°. При положи­тельной бродильной пробе присутствие кишечной палочки (читается доказанным. Результат выражается коли-индек-гом. Например, на фильтре образовались 2 колонии Е. coli; i.ik как фильтровали 500 мл воды, то в 1 л будет 2X2 = I бактерии. Если коли-индекс равен 4, то коли-титр равен 1000 : 4 = 250.

Методика выявления в воде патогенных микробов опи-« .ша в соответствующих разделах специальной части.

Определение коли-титр а молока и безал­когольных напитков проводят также методом по-

101

следовательных разведений в специальных питательных сре­дах, предусмотренных соответствующими ГОСТ.

Методика санитарн о-б актериологического исследования мяса, мясных, молочных и других пищевых продуктов имеет сходство с правилами исследования их при пищевых токсикоинфекциях (см. стр. 215) и проводится соответственно, требованиям ГОСТ.

Исследование воздуха. Санитарно-гигиеническое исследо­вание воздуха включает определение общего количества микробов в 1 м³ и выявление патогенных стафилококков и стрептококков. Пробы воздуха отбирают чашечным — седи-ментационным и аспирационным методом.

Чашечный метод. Чашки Петри с мясо-пептонным агаром или со специальной средой для патогенных стафи­лококков, стрептококков (см. стр. 183, 186) устанавливают в открытом виде на различной высоте от пола. В среднем рекомендуют отбирать одну пробу на каждые 20 м² помеще­ния. Срок экспозиции зависит от предполагаемого количе­ства микробов в воздухе. При большом количестве микро­организмов чашки открывают на 5—10 минут, при малом — на 20—40 минут.

Посевы помещают в термостат при 37° на 24 часа и допол­нительно выдерживают 48 часов на рассеянном свету при комнатной температуре, после чего производят подсчет ко­лоний и изучают характер микрофлоры.

По данным В. Л. Омелянского, на поверхность среды пло­щадью в 100 см² оседает за 5 минут столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Например, на чашке с мясо-пептонным агаром при 5-минутной экспозиции выросло 32 колонии, следует вычислить количество микро­бов, находящихся в 1 м³ воздуха, применяя формулу Оме­лянского. Площадь чашки S = jtr² = 3,15 • 5² = 78,5 см². Зная площадь чашки и количество выросших колоний, можно оп­ределить, какое количество микробов (х) выросло бы при данной экспозиции на поверхности среды в 100 см²,

32 • 100 ло сч а

х — — =40. Это количество микробов содержалось

78,5

в 10 л воздуха, а в 1 м³ (1000 л) их будет ⁴⁰ * ^⁰⁰° = 4000.

Имеется специальная таблица расчета для определения общего количества микробов в 1 м³ воздуха. Количество колоний, подсчитанных на чашке с МПА, умножают на один из множителей (табл. 3).

102

Если в чашке с мясо-пептонным агаром площадью 78,5 см² при 10-минутной экспозиции выросло 40 колоний, то коли­чество микробов в 1 м³ воздуха будет равно 40X60 = 2400. Мри большей экспозиции вводят поправку, уменьшая мно-

Таблица 3

Расчет числа бактерий в 1 м³ воздуха при 10-минутной экспозиции

п/п	Диаметр чашки (в см)	Площадь чашки (в см2)	Множитель
'1	8	50	100
2	9	63	80
3	10	78,5	60

житель соответственно кратности увеличенной экспозиции. Приведенные расчеты используют и для количественного определения болезнетворных бактерий в воздухе (стафило­кокки, стрептококки и др.).

Аспирационный метод основан на ударном дей-ствии воздушной струи о поверхность питательной среды. Для исследования воздуха этим методом применяют аспира­ционный прибор Кротова. Воздух в количестве 50—100 л пропускают со скоростью 25 л в минуту над открытой чаш­кой с мясо-пептонным агаром или со специальной средой. В намеченной точке отбора проб аппарат включают в элек­тросеть, снимают крышку и устанавливают открытую чаш­ку с питательной средой. Рукой сообщают ей движение по часовой стрелке, закрывают крышку аппарата и включают мотор. Воздух поступает через клиновидную щель и с силой ударяется о поверхность питательной среды, на которой фик­сируются микробы. Вращение столика с чашкой Петри (1 об/сек) обеспечивает равномерное распределение микро­организмов по всей поверхности питательной среды. По ис­течении заданного времени чашку-с посевом воздуха сни­мают, закрывают ее и помещают в термостат.

Допустим, на чашке при подсчете обнаружено 250 коло­ний, воздух пропускали 2 минуты со скоростью 25 л в ми-нуту. Всего было пропущено 50 л воздуха. Число микробов

. • , 250 • 1000 _ктп в 1 м³ воздуха равно — = 5UUU.

Изучение характера микрофлоры проводят обычным спо­собом, описывают выросшие колонии, приготовляют из них мазки, выделяют чистые культуры и идентифицируют их.

103

Таблица 4 Учет различных свойств выделенных культур	Виды выделенных бактерий
	Ферментативные свойства	пептонная вода		индол
				• ^ X
		молоко
		лактоза
		глюко­за
	Культуральные свойства	характер роста на:	пептонной воде
			скошен­ном агаре
			чашке с МПА
	Тинктори-альные свойства
	Морфология J	под­виж­ность
		форма

В качестве временных норм для лечебно-профилактических учреждений пользуются следую­щими показателями санитарно-гигиенического состояния возду­ха: в хирургических операцион­ных общее количество микробов до начала операции допускается не свыше 500 в 1 м³, после опера­ции — 1000.

В предоперационных и перевя­зочных комнатах предельная нор­ма микробов до начала работы 750 микробов в 1 м³, после рабо­ты — 1500.

В родильных палатах общее количество микробов допускает­ся до 2000 в 1 м³ воздуха, стафи­лококков и стрептококков — не выше 24 в 1 м³, а в комнатах но­ворожденных — 44 в 1 м³.

В остальных больничных поме­щениях в зависимости от количе­ства патогенных кокков и общего количества микробов в 1 м³ раз­личают чистый, слабо загрязнен­ный и загрязненный воздух.

Допустимых норм санитарно-гигиенического состояния воздуха в жилых помещениях пока не имеется. В таких помещениях ре­комендуют проводить исследова­ние воздуха в разное время дня (до и после ухода на работу и т. д.). Качество уборки и дезин­фекции оценивают по результа­там бактериологического иссле­дования воздуха до и после этих операций.