6.7. Исследование полевого материала
6.7.1. Материалом для исследования служат иксодовые клещи, органы птиц и грызунов (головной мозг, печень), пробы крови крупного и мелкого рогатого скота.
6.7.2. Подготовка клещей
Клещей группируют по видам, полу, месту и времени сбора. Взрослых голодных или полунапившихся клещей (имаго) объединяют в пулы по 10 экземпляров, нимф – от 20 экз. до 50 экземпляров, личинок – не менее 200 особей. Напившихся особей исследуют индивидуально.
Для исследования методом ИФА клещей однократно промывают физиологическим раствором. Замораживают при температуре минус 20 оС или в жидком азоте в течение нескольких часов. Далее клещей тщательно растирают в фарфоровой ступке и к гомогенатам добавляют раствор, заложенный в диагностическую тест-систему, из расчета 0,2 мл на одного клеща. При отсутствии специальной среды для разведения образцов используют 0,9 % раствор натрия хлорида (физиологический раствор). Полученную суспензию переносят в коническую пробирку и инактивируют на водяной бане при температуре плюс 56 оС в течение 30 мин. Осветленную после центрифугирования или отстаивания суспензий в течение 1 - 2 ч при температуре 4 оС надосадочную жидкость используют для исследования. При необходимости повторного исследования проб в более поздние сроки в суспензии добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 или антибиотики (80 мг гентамицина на 1 л среды или 500 ЕД пенициллина и 500 ЕД стрептомицина на 1 мл среды) и хранят при температуре 40С или замораживают.
Для исследования методом ПЦР клещей однократно промывают физиологическим раствором. Затем замораживают при температуре минус 20 оС или в жидком азоте в течение нескольких часов. Переносят в охлажденную фарфоровую ступку, добавляют охлажденную транспортную среду (физиологический раствор) и гомогенизируют. Переносят пробу в микроцентрифужную пробирку, используя наконечники с аэрозольным фильтром. Полученную пробу центрифугируют при 5000 об/мин в течение 1 мин для осветления материала. РНК выделяют из надосадочной жидкости. РНК вирусов быстро гидролизуется РНК-азами, поэтому РНК-содержащий материал должен подвергаться немедленному исследованию или храниться при температуре минус 70 оС.
Для вирусологического исследования каждую пробу отмывают стерильным физиологическим раствором не менее 5 раз. Далее клещей замораживают при температуре минус 20 оС или в жидком азоте в течение нескольких часов. Затем клещей помещают в стерильную охлажденную ступку и тщательно растирают с физиологическим раствором или с культуральной средой. Для инактивации бактериальной флоры добавляют антибиотики (80 мг гентамицина на 1 л среды или 500 ЕД пенициллина и 500 ЕД стрептомицина на 1 мл среды). Приготовленную в ступке взвесь помещают в пробирку и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин при охлаждении. Подготовленные суспензии до момента заражения новорожденных белых мышей или культуры клеток помещают в сосуд с тающим льдом. Исследуют надосадочную жидкость.
6.7.3. Подготовка суспензий органов животных.
Кусочки органов (головной мозг, печень) растирают в фарфоровой ступке пестиком, добавляя при этом небольшое количество стерильного стеклянного песка, и раствор для разведения образцов, заложенный в диагностическую тест-систему (4 мл на 1 г органа), а при его отсутствии физиологический раствор. Полученную суспензию инактивируют и исследуют надосадочную жидкость, как указано в п. 10.2.
6.7.4. Проведение иммуноферментного анализа осуществляют согласно инструкциям, прилагаемым к тест-ситемам «ВектоКрым-КГЛ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Кольцово Новосибирской обл.) и «ИФА-АГ-КГЛ » (ЗАО Биотехнологическая компания «Биосервис», г. Боровск Калужской обл.).
6.7.5. Для выявления РНК вируса ККГЛ в суспензиях клещей используют метод ОТ-ПЦР в соответствии с инструкцией к тест-системам («Ампли Сенс® ККГЛ», ООО «ИнтерЛабСервис», ФГУН ЦНИИЭ, г. Москва, и «ГенКонго», ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г. Саратов).
6.7.6. В сыворотках крови животных определяют антитела класса G к вирусу ККГЛ с помощью конъюгата белка А с пероксидазой хрена производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л. Пастера (г. Санкт-Петербург).
6.7.7. Вычисление вирусофорности клещей проводят по формуле (Беклемишев В.Н., 1963):
где
X - процент зараженных эктопаразитов в исследуемой партии; lg N - десятичный логарифм общего числа исследований; lgno - десятичный логарифм числа исследований, давших отрицательный результат; m - число эктопаразитов в пробе (пробах).