1. Экспериментальные моменты

Стерильная работа

Выполняя любые микробиологические эксперименты, важно не занести бактерий из внешней среды. Так как бактерии находятся везде – на кончиках пальцев, на поверхности стола, в воздухе и.т.п. важно минимизировать контакт образцов с окружающей средой. Когда ученики работают с петлями, пипетками или чашками Петри, вы должны подчеркнуть, что к кончику петли, носику пипетки или поверхности чашки нельзя прикасаться ни при каких обстоятельствах. Несмотря на то, что небольшое загрязнение вряд ли сильно повлияет на этот эксперимент, привычка к чистой работе в будущем пригодится ученикам. Использование стерильной техники это также и вопрос человеческого здоровья и гигиены.

Использование пипетки

Перед началом лабораторных занятий, покажите ученикам градуировки на пипетке. В качестве единицы измерения в течение работы будет применяться как 250 мкл так и 1 мл

Деконтаминация и обращение с отходами

При отсутствии автоклава, все растворы и принадлежности (петли и пипетки), входившие в контакт с бактериями, помещаются по меньшей мере на 20 мин в 10% раствор хлорки для стерилизации. Ванночка с таким раствором должна стоять в каждом рабочем помещении. Все использованные петли и пипетки должны быть собраны для стерилизации. Для стерилизации чашек Петри они покрываются сверху 10% раствором хлорки и выдерживаются как минимум час, после этого жидкость выливается в канализацию, а чашки заворачиваются и далее рассматриваются как обычный мусор. При работе с раствором хлорки рекомендуется использование защитных очков.

Инкубация

Это руководство предполагает использование термостата на 37ºС. Эксперимент может быть выполнен и без использования термостата, однако тогда клеткам понадобится больше времени, чтобы вырасти. Лучше всего, чтобы колонии на «стартовых» чашках были свежие (24-36 ч) и достигали 1-1.5 мм в диаметре. Хранение засеянных чашек в холодильнике существенно снижает эффективность последующей трансформации.

Оптимальная температура для роста E. coli - 37ºС., при более низкой температуре они будут расти медленнее. При 28 градусах на то ,чтобы колонии достигли нужного размера, потребуется 2 дня, при 21 градусе – 3 дня. Подготовьте ваше расписание в соответствии с предполагаемым временем роста клеток.

Практикуйте методики

Некоторые учителя любят заранее показать, как нужно проводить те или иные процедуры, объяснить использование петель и пипеток, и растирание бактерий по агару. Вы должны сами решать, что лучше подходит для ваших учеников, основываясь на их опыте. Тщательное выполнение следующих пунктов гарантирует успех работы

Подготовка «стартовых» чашек E. coli

Чтобы приготовить агар, лучше использовать колбу, а не стакан. Убедитесь, что агар полностью растворился, так как неровное перемешивание может привести к тому, что агар не застынет. Старайтесь минимизировать загрязнение из внешней среды (см. Подготовка к работе шаг 1)

После того, как на стартовых чашках выросли посеянные E. coli, их надо использовать для трансформации в течение 24-36 ч. При дальнейшей отсрочке эффективность трансформации будет снижаться.

Перенос колоний с чашек в микропробирки

В процессе переноса колонии с поверхности агара хочется взять больше клеток, чем реально нужно. Одиночная колония 1 мм в диаметре содержит миллионы бактериальных клеток. Чтобы увеличить эффективность трансформации, ученики должны взять 2-4 крупных колонии (1-1.5 мм в диаметре). Если взять больше 4 колоний, это может снизить эффективность. Выбирайте отдельные колонии, не берите бактерии оттуда, где они растут слишком густо – для того, чтобы трансформация была успешной, бактерии должны активно расти.

Перенос ДНК

Перенос ДНК из стоковой пробирки в пробирку с трансформационной смесью является чрезвычайно важным моментом. Ученики должны внимательно посмотреть на петлю, чтобы увидеть, есть ли на ней пленка раствора плазмиды. (она выглядит как пленка мыльного раствора на кольце, когда вы выдуваете мыльные пузыри). Или ваши ученики могут капнуть микропипеткой 10 мкл раствора плазмиды в пробирку с трансформационной смесью («+pGLO») и хорошо перемешать.

Тепловой шок

Процедура, используемая для того, чтобы увеличить проникновение ДНК в клетки бактерий, называется тепловым шоком. Важно, чтобы ученики точно следовали указанием относительно времени шока. Также важна быстрая смена температуры в этом процессе. Для достижения наилучшего результата, пробирки с трансформационной смесью нужно снять со льда, поместить на 50 секунд на 42ºС и затем поставить обратно на лед. Отсутствие теплового шока снизит эффективность трансформации на порядок (в 10 раз); 90 секунд теплового шока даст в два раза меньше трансформантов, чем 50 секунд. В обоих случаях эксперимент сработает, тем не менее, он был оптимизирован для 50-секундного теплового шока. Будьте уверены, что вы используете мелко нарубленный лед или снег (а не крупные кубики льда). Используйте два термометра, чтобы максимально точно контролировать температуру.

Растирание трансформационной смеси по чашкам

Наливание лишнего количества трансформационной смеси на чашки не продуктивно, потому что чашки могут не впитать лишнюю жидкость, и распределение будет неровным. Перенос суспензии из микропробирок на чашки требует аккуратности. Бактерии осядут на дно пробирки, и вашим ученикам потребуется перемешать их, зажав верхнюю часть пробирки между большим и указательным пальцами и постукивая указательным пальцем другой руки по дну пробирки. Убедитесь что ученики перемешали содержимое пробирки таким образом, или с помощью пипетки, перед тем как они будут наносить суспензию на чашку. Также убедитесь, что ученики закрыли свои чашки крышками сразу же после того как нанесли и растерли по ним суспензию. Для того, чтобы ровно растереть суспензию по поверхности агара, используйте плоскую поверхность новой стерильной петли, или стеклянный шпатель (последний можно быстро стерилизовать, опуская его в спирт и прожигая на спиртовке).

Набор по выделению зеленого флуоресцентного белка

Если вы хотите продолжить эксперимент и выделить белок, вам нужно сохранить бактерий, выросших на чашках LB./amp и LB/amp/ara. Для этого нужно хранить чашки в холодильнике, перевернутыми крышками вниз (для того, .чтобы конденсирующаяся на крышке жидкость не капала на поверхность агара). При этом клетки будут живыми, но практически не будут расти. В таком состоянии можно хранить чашки 2-4 недели. Если вам нужно хранить чашки дольше, заверните их в пленку, чтобы они не пересохли.