Акарифаги та ентомофаги з класу павукоподібних.

Підклас кліщів поділяють на три ряди і багато родин. Значна кількість видів кліщів є рослиноїдними, в тому числі небезпечними шкідниками рослин (павутинні, галові, комірні та інші кліщі). Деякі види спричинюють захворювання людей і тварин, але серед представників цього підкласу відомо також багато ентомофагів та акарифагів. Це переважно хижаки і ектопаразити, деякі види знищують дрібних нематод.

Для біологічної боротьби з шкідниками рослин в умовах закритого грунту широко використовують хижого кліща фітосеюлюса (Phytoseiulus im iMinilis Ath. henr.) з родини Phytoseiidae ряду Parasitiformes. До цієї родини належить ще багато активних акарифагів, які знищують плодових кліщів у садах: тифлодромус Typhlodromus tiliarum Oudem., метасейулюс (Meta' iiilus longipilus Nesb.), амблісейулюс (Amblyseiulus fmlandicus Oudem), кампімодромус (Kampimodromus aberrans And.) та ін. За літературними даними, деякі види фітосеїд можуть живитися також дрібними яйцями комах, трипсами, білокрилками. При відсутності кліщів фітосеїди деякий час можуть живитись пилком, медвяною росою та соком рослин.

Ефективні ентомофаги відомі і в родині паразити (Parasitidae), зокрема, види роду Parasitus висисають яйця короїдів у їхніх ходах. Вони є також ектопаразитами дорослих короїдів, хрущів та інших жуків.

Багато родин ряду Acariformes представлені хижими видами ентомофагами та акарифагами. Найбільший інтерес становлять родини червонотілки (Trombidiidae) та аністиди (Anystidae).

Важливим ентомофагом є саранова червонотілка (Eutrombium debilipes Leon.) червоний дуже рухливий кліщик, дорослі та німфи висисають яйця саранових у кубушках. Личинки ектопаразити саранових. Інші червонотілкові кліщі живляться яйцями та личинками дрібних комах попелиць, трипсів, листоїдів Кліщі Allotrombium ftiliginosum Ew. висисають яйця колорадського жука (Коваль Ю.В., 1973).

У багатьох районах країни поширені кліщики родини анистид, зокрема, Anystis baccarum L. Він також червонуватого кольору, висисає яйця та дрібних личинок попелиць, листоблішок, звичайного павутинного та плодових кліщів, щитівок, підкорового клопа. Поширений частіше в садах, лісосмугах, менше на полях.

Практична робота № 5 Вивчення мікробіологічних агентів, які викликають захворювання комах.

Мета заняття. Придбання практичних навиків в приготуванні мікроскопічних препаратів і визначенні захворювань та патогенних організмів у комах.

Устаткування і матеріали. Комахи (личинки, лялечки лускокрилих, клопи), мікроскопи МБР–1, предметні і покривні стекла, платинові та препарувальні голки, препарувальні ванни, ножиці, спиртівки, дистильована вода, етиловий спирт (70 % розчин), дистильована вода. імерсійне масло, барвники.

Інформаційний матеріал.

Збір комах в природі.

Для виявленні хворих необхідно відібрати комах, які мають ознаки захворювання. Для активних фаз розвитку комах до цих ознак відносяться: уповільнення і припинення рухів, параліч, припинення живлення, потемніння та інші зміни природного забарвлення, укорочення волосків і щетинок, рідкі виділення з кишечника і ротового отвору, уповільнена реакція, виділення каламутної рідині у відповідь на дотик до тіла.

Одночасно з живими необхідно збирати загиблу гусінь, що повисає на рослинах часто вниз головою, а також мертвих комах, які зустрічаються на поверхні ґрунту. Якщо серед загиблих зустрічаються такі, що вижили, то в першу чергу звертають увагу не ті особини, які мають зменшені в порівнянні із здоровими розміри тіла і деформацію окремих органів (ротові частини, ноги, крила). Збирають кладки яєць та лялечок, які менші в порівнянні зі здоровими.

Зовнішній огляд комах.

У лабораторії зібраних комах сортують відповідно до видів та вигляду, за яким часто можна визначити до якої групи відноситься збудник хвороби. Так, при ураженні деякими грибними хворобами тіло комах муміфікується, а загиблі попелиці, гусениці совки-гамми, кільчастого шовкопряда та деяких інших видів при ентомофторозі щільно прикріплені до субстрату і насилу відділяються від нього. При ураженні боверією і близькими видами мускардин муміфікована поверхня тіла покривається нальотом білого, рожевого або зеленого забарвлення в залежності від виду гриба.

При ураженні хвороботворними споровими бактеріями, наприклад Bacillus thuringiensis Berl., у комах спостерігається параліч і припинення живлення. Тіло загиблих гусениць покрите плямами, які часто зливаються в суцільне побуріння або почорніння шкірних покривів. Останні не розриваються, як при вірусній інфекції, а при натисканні на тіло з рота і анального отвору з'являється рідина з неприємним гнильним запахом.

Гусениці перших двох віків, які заражені вірусами, мало відрізняються від здорових. Починаючи з 3-го віку, вони стають малорухливими і пересуваються до верхівок рослин. У разі загибелі вони зачіпляються за стебло, гілку або стовбур рослини задньою або середньою парою грудних ніг і звисають вниз зазвичай головним кінцем тіла, яке наповнюється рідиною. У «голих» гусениць за рахунок каламутної гемолімфи, яка просвічує через покриви, забарвлення тіла білувате або жовтувате, з переходом до темно-бурого або чорного кольору. У опушених гусениць зміна забарвлення мала помітно. У загиблих гусениць шкірні покриви розм'якшуються, легко розриваються, але рідина, що витікає не має гнилісного запаху.

Комахи, заселені микроспорідіями або нематодами, відстають в розвитку, а у разі загибелі їх тіло зморщується, засихає, іноді покривається темними плямами.

Завдання. Провести мікроскопічний аналіз комах.

Хід роботи.

При виявленні на тілі комахи грибного нальоту, необхідно взяти прожареною препарувальною голкою невелику частину і перенести її на предметне скло в краплю води, закрити покривним склом і мікроскопувати.

У решті випадків спочатку проводять поверхневу стерилізацію комахи, щоб уникнути попадання сапрофітних мікроорганізмів. Для цього комаху необхідно прогріти (провести через вогонь спиртівки), занурити на 1–3 хв. в 70% розчин спирту. Потім виготовляють мікроскопічні препарати з урахуванням фази розвитку комахи.

Яйця комах роздавлюють, видаляють хоріон і переглядають під мікроскопом в краплі води. У личинок роблять укол стерильною препарувальною голкою і краплю гемолімфи випускають на предметне скло. Крім того, беруть платиновою голкою і поміщають в краплю води шматочок гіподерми, жирового тіла і епітелію середньої кишки.

У лялечок роблять поперечний розріз тіла між 2-м і 3-м черевними сегментами і микроскопуют шматочки мальпігієвих судин, середньої кишки і жирового тіла.

У імаго після стерилізації шкірних покривів видаляють сильно хитинізовані частини тіла і готують препарати гемолімфи, гіподерми і жирового тіла.

При зараженні грибами на препаратах гемолімфи і жирового тіла можна виявити різні стадії розвитку збудника хвороби — гіфальні тіла, конідії, спори, які зазвичай добре помітні без забарвлення. У необхідних випадках контрастність підсилюють фарбуванням 1% розчином метиленової сині, сафраніну, еозину, фуксину та інших анілінових фарбників. Препарат, після видалення надлишку фарби, проглядають в краплі води.

Бактерії і їх спори можна виявити в нефарбованих препаратах при великому збільшенні мікроскопа (спори сильно переломлюють світло). Надійніше визначати бактерії у фарбованих препаратах. Найшвидше це можна зробити з допомогою карболового фуксину Циля за методом Шевцової, який не потребує попереднього фіксування матеріалу.

Реактиви: карболовий фуксин Циля (1 г основного фуксину розтирають у фарфоровій ступці з 10 мл спирту і до отриманої маси додають 5 г кристалічної карболової кислоти. До суміші при розтиранні поступово додають 100 мл дистильованої води), дистильована вода, імерсійне масло.

Хід аналізу. На предметне скло наносять краплю гемолімфи. Після підсушування, наливають барвник на 30..60 сек. потім промивають водою. Висушують препарат за допомогою фільтрувального паперу. Переглядають під імерсією при ×1300 — 1500. Кристалічні включення забарвлюються в червоний колір, спори бактерій не фарбуються.

Крім того для фарбування можна використовувати 2,5% спиртово-водні розчини звичайних бактеріологічних фарб — метиленової сині, генциан-віолету, метил-віолету, а також забарвлення по Граму, але в цьому випадку потрібна попередня фіксація препарату (3-кратне проведення через вогонь спиртівки, або спиртово-ефірну сумішь (1:1)). Потім наносять барвник на 1…3 хв.

Віруси можна виявити лише за допомогою електронного мікроскопу. Проте кристалічні білкові включення — поліедри, які різко переломлюють світло, видно в світловий мікроскоп, особливо якщо вони зустрічаються у великій кількості. Діагностичною ознакою для розпізнавання ядерних і цитоплазматичних поліедрозів є відміни у ступені забарвлення їх поліедрів – цитоплазматичні поліедри забарвлюються нейтральним розчином метиленової сині, тоді як ядерні поліедри фарбуються лише після попередньої обробки кислотою або лугом. Крім того використовують методику Шевцової.

Реактиви: 70 % спирт (90 мл) з додаванням 10 мл 40 % формаліну, 1 % розчин їдкого натрію, 5 % водний розчин еозину.

Хід аналізу. На предметне скло наносять краплю досліджуваної рідини або тканину. Після висушування на повітрі препарат фіксують сумішшю спирту з формаліном протягом 10—20 хв. На просушений між листами фільтрувального паперу препарат рясно наливають розчин лугу. Через 1 хв луг змивають водою і препарат забарвлюють розчином еозину протягом 3—5 хв. Поліедри фарбуються в рівномірно рожевий колір. Бактерії і їх спори, а також спори грибів і тканинні елементи не забарвлюються.

Найдрібніші гранули гранульозу погано видно в світловий мікроскоп і мають вигляд зерняток, які коливаються та не забарвлюються звичайними способами. Їх можна фарбувати в червоний колір за допомогою карболового розчину фуксину Циля за методикою Швецової.

Реактиви: 70 % спирт з формаліном, 1 % розчин їдкого натрію, карболовий фуксин Циля (1 г основного фуксину розтирають у фарфоровій ступці з 10 мл спирту і до отриманої маси додають 5 г кристалічної карболової кислоти. До суміші при розтиранні поступово додають 100 мл дистильованої води).

Хід аналізу. Готують два мазки для порівняльного перегляду. Це робиться для того, щоб виключити дрібні бактерії, які можуть бути прийняті за гранули. Після висихання, мазки фіксують розчином спирту з формаліном (10 хв). Після видалення фіксатора за допомогою фільтрувального паперу, один із мазків обробляють протягом 1 хв їдким натром і промивають водою. Потім обидва мазки обробляють карболовим фуксином Циля протягом 1 хв, промивають водою і просушують. У препараті, який не оброблений лугом, гранули вірусу не забарвлюються, а бактерії і інші мікроорганізми забарвлюються. У обробленому лугом препараті гранули вірусу забарвлюються в червоний колір.

При ураженні комах мікроспоридіями в мазках, які приготовані з різних тканин, можна виявити різні стадії розвитку паразита.

При заселенні нематодами їх присутність можна виявити у водному нефарбованому препараті неозброєним оком або під лупою. При малому збільшенні мікроскопа видно дорослі особини, личинки і яйця паразита.