Питання для самоконтролю

1. Що Ви розумієте під поняттям живильне середовище?

2. Розкажіть про класифікацію живильних середовищ?

3. Які це універсальні, спеціальні, елективні, селективні, диференціально-діагностичні середовища?

Лабораторна робота №6

Тема: Методи стерилізації поживних середовищ і лабораторного посуду

Мета роботи. Ознайомитись з методами стерилізації. Навчитись готувати до стерилізації в автоклаві та в сушильній шафі лабораторний посуд (чашки Петрі, піпетки, колби, пробірки, шпателі), живильні середовища, розчини.

Об’єкт та матеріали. Автоклави, парові стерилізатори, сушильні шафи, чашки Петрі, піпетки, колби, пробірки, папір для загортання скляного посуду.

Завдання

2. Підготувати до стерилізації в автоклаві та в сушильній шафі лабораторний посуд (чашки Петрі, піпетки, колби, пробірки, шпателі), живильні середовища, розчини.

Теоретична основа

Стерилізація – один з найважливіших прийомів у мікробіологічній практиці. В практичній роботі стерилізацію трактують, як методи які застосовують для знищення всіх форм життя як на поверхні, так і всередині об’єктів стерилізації. Стерилізують живильні середовища, посуд, інструменти з метою не допустити розвитку сторонніх мікроорганізмів у досліджуваних культурах. Розрізняють стерилізацію такі методи стерилізації: термічну, хімічну, фільтруванням та опроміненням.

Термічна стерилізація

Прожарювання вогнем (фламбування) застосовують безпосередньо перед використанням для стерилізації петель, голок, пінцетів, ножиць, шпателів, скляних паличок, предметних та покривних скелець та іншого дрібного інструменту.

Кип’ятіння у воді використовують для стерилізації шприців, голок, пінцетів, скальпелів, дрібного скляного посуду, фільтрів у стерилізаторах. При цьому гинуть, в основному, вегетативні клітини, спори бактерій зберігають життєздатність.

Пастеризація – одноразовий короткочасний прогрів матеріалу при температурах, нижчих 100°С для знищення вегетативних форм мікроорганізмів. Цей прийом запропонував Луї Пастер. Пастеризацію часто застосовують у харчовій промисловості, для обробки продуктів, які втрачають смакові і поживні якості при кип’ятінні: молока, овочевих і фруктових соків, вин, пива та ін. Пастеризацію зазвичай проводять при 60°С–75°С протягом 15–30 хв чи при 80°С 15 хв. Інколи нагрівають матеріал до 90°С і одразу ж охолоджують.

Стерилізацію сухим жаром при температурі 170°С, 160°С або 140°С здійснюють у сушильних шафах відповідно протягом 1 год, 2 год та 3 год. Нагрівання за допомогою сухого жару справляє значно слабший вплив на мікроорганізми, ніж волога пара. В той же час можуть серйозно пошкоджувати такі матеріали, як гума, папір, вата, тканина. Тому цей прийом переважно використовують для стерилізації предметів, які є непроникними для пари, зокрема посуду (чашок Петрі, колб, пробірок, піпеток тощо).

Температура в сушильній шафі не повинна перевищувати 170°С, оскільки у протилежному випадку з вати та деяких сортів паперу можуть виділятися смолисті речовини, жирні кислоти, які мають здатність пригнічувати ріст мікроорганізмів. Ці речовини у невеликих кількостях також можуть виділятися й при значно нижчих температурах, а при охолодженні шафи осаджуватись на її стінках. Тому час від часу слід очищувати стінки печі. Для попередження інтенсивного змішування холодного забрудненого повітря зі стерильним вмістом шафи, її небажано відкривати до охолодження.

Стерилізація насиченою парою під тиском (автоклавування) найбільш надійний і широко застосовуваний спосіб стерилізації живильних середовищ і посуду. Цей метод ґрунтується на нагріванні матеріалу насиченою водяною парою при тиску, вищому від атмосферного. Відомо, що температура пари зростає при підвищенні її тиску. Наприклад, при тиску 1,5 атм. температура пари становить 127°С, 2 атм. – 135°С.

А втоклавування забезпечує високу ефективність стерилізації: гинуть вегетативні клітини, і найстійкіші спори. Стерилізацію парою під тиском здійснюють у спеціальних герметичних товстостінних апаратах – автоклавах. Для правильного автоклавування необхідно повністю витіснити повітря з робочої камери, оскільки повітря затримується між предметами, які автоклавуються, внаслідок чого вони можуть не нагріватися до заданої температури. Крім того, заповнювати автоклав слід таким чином, щоб не перешкоджати вільному рухові повітря.

Перед стерилізацією живильні середовища і посуд слід ізолювати від зовнішнього середовища. Для цього колби і пробірки закривають ватними корками: чашки Петрі, піпетки, шпателі загортають у папір чи кладуть у паперові пакети. Посуд, зазвичай, стерилізують при 1 атм. 20-30 хв.

Температура і тривалість автоклавування живильних середовищ визначається, перш за все, їх складом. Термолабільні субстрати (молоко, желатинові середовища, середовища з цукрами, вітаміни тощо) зазвичай стерилізують при 0,5 атм., протягом 15-30 хв, пивне сусло та сусло-агар при 0,7 атм 20 хв, м’ясо-пептонні середовища при 1 атм. 20 хв.

Працювати з автоклавом слід обережно, дотримуючись інструкцій. Оскільки автоклав – апарат, який працює при високому тиску і високій температурі, неправильна експлуатація його може бути причиною нещасних випадків. Для роботи з автоклавом допускаються тільки особи, які мають спеціальну підготовку і дозвіл відповідної інстанції.

Основні правила роботи з автоклавом

1. Перед початком роботи слід ретельно оглянути автоклав, його контрольно-вимірювальну апаратуру, перевірити пружність резинової прокладки, кріплення кришки стерилізаційної камери.

2. Через спеціальну лійку до рівня відмітки на водомірній трубці в автоклав заливають дистильовану воду і закривають кран.

3. Необхідний матеріал вміщують у стерилізаційну камеру і закривають герметично кришкою автоклава. Бажано стежити, щоб предмети не розташовувалисьв автоклаві дуже тісно, оскільки між ним повинна проходити пара. В іншому випадку вони можуть залишитись нестерильними через відсутність нагріву до необхідної температури.

4. Відкривають кран, який з’єднує стерилізаційну камеру з оточуючим середовищем, і включають електричний нагрів.

5. Після того, як почався процес утворення пари, необхідно видалити повітря із стерилізаційної камери. Для цього пару і конденсат відводять у спеціальну посудину з водою або в каналізацію. Чисту пару, яка виходить з автоклава з рівномірним шиплячим звуком, протягом 10 хв пропускають через камеру, а потім закривають паровідвідний кран.

6. Доводять тиск пари до рівня, якого вимагає режим стерилізації. Для цього враховують співвідношення показників тиску манометра і температури кипіння води (табл.).

Таблиця. Залежність між надлишковим тиском пари, температури кипіння води і тривалістю стерилізації

Тиск пари, атм	Температура, ºС	Час стерилізації, хв
0	100	30-60
0,5	112	20-30
1,0	121	15-20
1,5	127	15-20
2,0	134	15

7. По завершенні циклу стерилізації автоклав відключають. Тиск в автоклаві поступово падає і зрівнюється з атмосферним. Тоді відкривають випускний кран і поступово випускають надлишок пари у посудину з водою. Недотримання цих правил може призвести до різкого зниження тиску, внаслідок чого рідина в пробірках, колбах, які стерилізувались, бурхливо закипає, змочуючи ватно-марлеві пробки і навіть виштовхуючи їх. Така ситуація порушує стерильність матеріалу.

В автоклаві при 120 °С протягом 20 хв стерилізують прості живильні середовища (МПБ, МПА), ізотонічні розчини, білизну, перев’язочний матеріал, а при 134 °С – знешкоджують заразні матеріали, відпрацьовані культури бактерій протягом 40 хв. Середовища з вуглеводами не витримують такої обробки, оскільки вони карамелізуються, у зв’язку з чим їх стерилізують текучою парою.

Для контролю правильного режиму стерилізації використовують кілька методів: за допомогою прямого вимірювання температури, максимальних термометрів або хімічних індикаторів. Перший спосіб здійснюють за допомогою термопар, розташованих в різних частинах камери. Зручнішим є використання максимальних термометрів та патентованих хімічних індикаторів. Останні змінюють своє забарвлення внаслідок прогрівання протягом певного часу при заданій температурі.