1. Специфичность действия сахаразы дрожжей

Фермент сахараза катализирует гидролитическое расщепление са­харозы с образованием глюкозы и фруктозы.

Действие фермента можно обнаружить по появлению свободной глюкозы, дающей положительную качественную реакцию на свободный

полуацетальный гидроксил (реакция "серебряного зеркала", с реактивом Фелинга и т.п.). Сахароза не содержит свободного полуацетального гид­роксила, поэтому в подобные превращения не вступает.

П

\

Приборы и реактивы: весы, воронка, пробирки, термометр, держатель для проборок, ступка фарфоровая с пестиком, водя­ная баня, секундомер, бумажный фильтр, 1 % раствор сульфат

меди, 10 % раствор гидроксида натрия.

Выполнение работы. Для получения сахаразы навеску 0,5 г высушенных пекарских дрожжей тщательно растирают в ступке для разрушения дрожжевых клеток. Затем в ступку добавляют

5 Мл дистиллированной воды и вновь продолжают растирать полученную массу. Через некоторое время полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр. В фильтрате и содержится фермент сахараза.

В 2 пробирки помещают по 1 мл раствора сахаразы и приливают: в 1 пробирку - 1 мл 5 % раствора сахарозы; во 2 - 1 мл 5 % раствора крах­мала. Пробирки помещают в водяную баню с температурой 36-38 °С и выдерживают при этой температуре 15 мин.

Из каждой пробирки отбирают пробы объемом около 0,5 мл: добав­ляют в пробу по 10 капель 10 % раствора NaOH и по 3 капли 1 % раство­ра CuS0₄. Затем пробы перемешивают и нагревают до кипения. Образо­вание красного или желтого осадка свидетельствует о наличии в пробе глюкозы.

Полученные результаты оформляют в виде таблицы.

№ пробы	Фермент (сахараза), мл	Раствор сахарозы, мл	Раствор крахмала, мл	Наличие свободной глюкозы
1	1	1
2	1		1

2. Качественные пробы на присутствие ферментов

Амилаза относится к группе гидролаз, катализирующих гидролиз полисахаридов до более простых соединений (ди- и моносахаридов). Вы­рабатывается в слюнных железах и поджелудочной железе. Резкое уве­личение активности амилазы в сыворотке крови имеет решающее значе­ние при диагностике заболеваний поджелудочной железы.

Приборы и реактивы. Воронка, водяная баня, стаканы на 100 мл, колбы на 100 мл, термометр до 100 °С, фарфоровая пла­стинка, раствор крахмального клейстера, 1%-ный раствор йода в

йодистом калии, фелингова жидкость.

Выполнение работы.

Приготовление разбавленной слюны

Ополаскивают 2-3 раза рот, чтобы удалить остатки пищи. Отме-

ряют цилиндром 20 мл дистиллированной воды, сливают ее в стакан и ополаскивают ею рот в течение 1 -2 минут, выливают жидкость в другой стакан или колбу. Эту операцию повторяют 2-3 раза. Собранную жид­кость (примерно 50-60 мл) фильтруют через вату и фильтрат употребля­ют для работы.

а) Гидролиз крахмала под действием амилазы слюны

В две пробирки наливают по 5 мл крахмального клейстера и в одну из них 5 мл воды, а в другую 5 мл раствора слюны. Обе пробирки со стеклянными палочками одновременно помещают в водяную баню при 40 °С. Через несколько секунд наблюдают уменьшение опалесценции жидкости в пробирке со слюной вследствие образования растворимого крахмала. Через 1 минуту с момента нагревания пробирок в водяной бане от каждой смеси отбирают с помощью стеклянной палочки по капле жидкости и смешивают ее с каплей заранее нанесенного на пластинку йода. Повторяют подобное исследование действия фермента через 2, 4, 6, 8 минут. Окраска с йодом проб жидкости из пробирки со слюной меняет­ся от синей к сине-фиолетовой, буро-красной, красной и наконец желтой, т.е. сохраняется цвет йода. После этого к оставшейся жидкости в опыт­ной пробирке добавляют ] -2 мл фелинговой жидкости и смесь нагревают на пламени горелки до начала кипения. Образуется красный осадок заки­си меди. Восстановление окиси меди в закись меди производится образо­вавшейся мальтозой, а также низкомолекулярными декстринами. Жид­кость в контрольной пробирке (вода) не изменяется при стоянии в водя­ной бане: пробы ее дают синее окрашивание с йодом, и она не восстанав­ливает гидрата окиси меди в закись меди.

/Л

б) Активация и ингибирование амилазы Реактивы. Хлорида натрия, сульфат меди, 1 % раствор крахма­ла, разбавленная слюна, лед, 1%-ный раствор йода в йодистом калии

Выполнение работы. В две пробирки вносят по 1 мл раствора хлорида натрия, сульфата меди, а в 3 пробирку - дистиллиро­ванную воду. Во все пробирки добавляют по 2 мл раствора крахмала и по 1 мл раствора разбавленной слюны. Все 3 пробирки одно­временно помещают в водяную баню при 38 °С.

Через 10-15 минут все пробирки одновременно охлаждают под струей воды и помещают в стакан со льдом (ледяной водой). Во все про­бирки добавляют раствор йода. По окраске судят о скорости гидролиза крахмала.