Таблица 1 - Определение дегидрогеназы молока

Ха пробы	Состав смеси				Результаты опыта
	молоко в мл	формалин в мл	вода в мл	метиленовая синь в мл
1	5 (прокил.)	1	—	1
2	5	1	—	1
3	5	—	1	1 1

3, Количественное определение активности амилазы слю­ны по вольгемуту

Сущность метода. Метод количественного определения актив­ности амилазы слюны по Вольгемуту заключается в том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и то же количество крахмала, находят наименьшее со­держание фермента, которое полностью расщепляет все количество до­бавленного крахмала, затем проводят расчет на 1 мл слюны.

Амилазная активность слюны выражается количеством 1%-го рас­твора крахмала в мл, которое может расщепить 1 мл слюны при темпера­туре 38 °С в течение 30 мин.

Выполнение работы. В 10 пронумерованных пробирок нали­вают по 1 мл воды. В 1-ю добавляют 1 мл слюны, разведенной в 10 раз, перемешивают несколько раз, втягивая и выпуская жид­кость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси из первой пробирки, переносят ее во 2-ю; из 2-й таким же образом в 3-ю и т.д. из 10 пробир­ки, 1 мл смеси выливают. В каждой последующей пробирке, таким обра­зом, содержание фермента вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все 10 пробирок приливают по 1 мл воды и по 2 мл 0,1%-го рас­твора крахмала. Перемешивают, встряхивают (!) пробирки и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. Через 30 мин пробирки вы­нимают, охлаждают их водопроводной водой, во все добавляют по 1 кап-

ле раствора йода, перемешивают и отмечают окраску. Данные занести в таблицу.

№ про­ бирок	Кол-во раствора крахмала, мл	Разведение слюны	Температура опыта	Время реакции	Окрашива­ние йодом	Активность амилазы

Расчет: Рассчитывают количество слюны в последней пробирке с желтоватой окраской. Если слюна была разведена в ней, например, в 320 раз, то активность амилазы находят, составляя следующую пропор­цию:

1/320 слюны расщепила 2 мл 0,1%-го раствора крахмала 1 мл слюны расщепила X мл 0,1%-го раствора крахмала X = (2 • 1 • 320): 1 = 640 мл 0,1%-го раствора крахмала

4. Переваривание углеводов в желудочно-кишечном тракте

Приборы и реактивы. Амилаза слюны (слюна разведена дис­тиллированной водой 1:10), 1%-ный раствор крахмала, 10%-ный раствор NaOH, 1%-ный раствор сульфата меди (II), 1%-ная вод­ная суспензия целлюлозы, 5%-ный раствор панкреатина, желудочный сок, дистиллированная вода, термостат (37 °С), штатив с пробирками, пипетки вместимостью 1-2 мл.

ж

Выполнение работы. Готовят пробы соответственно таблице 2. Таблица 2 - Определение продуктов расщепления полисахарида с помощью реакции Троммера

№ пробы	Раствор крахмала, мл	Суспензия целлюлозы, мл	Слюна, мл	Желудоч­ный сок, мл	Панкреатин, мл
1	1,0	—	1,0	—	—
2	—	1,0	1,0	—
3	1,0	—	—	1,0	—
4	—	1,0	—	1,0
5	1.0	—	1,0	1,0	—
6	—	1.0	1,0	1,0	—
7	1,0	—	—	—	2,0
8	—	1,0	—	—	2,0

Для инкубации пробирки помещают в термостат при 37 °С на 30 мин. После инкубации содержимое каждой пробирки анализируют на присутствие продуктов расщепления полисахарида с помощью реакции Троммера. Для этого в каждую из 8 пробирок добавляют по 1 мл 10%-

ного раствора гидроксида натрия и по 5 капель 1 %-ного раствора сульфа­та меди. Осторожно нагревают верхнюю часть раствора в пробирке до закипания в пламени горелки и кипятят в течение 1 мин. Появление крас­ного осадка оксида меди (I) указывает на положительную реакцию Троммера в присутствии глюкозы и мальтозы.

Результаты опыта оформляют в виде таблицы.

№ пробы	Субстрат	Обнаружение продуктов реакции	Фермент расщепляю­щий углево­ды	Источник фермента	Отдел желу­дочно- кишечного тракта	Объяснение результатов

Оформление работы

Описать кратко и последовательно выполнение работы. Получен­ные результаты оформить в виде таблицы. Сделать вывод.

Контрольные вопросы

1. Как можно обнаружить присутствие фермента в исследуемом материале?

2. Перечислите основные факторы, влияющие на скорость фермен­тативной реакции.

3. Понятие об ингибиторах и активаторах.

4. Обратимое и необратимое ингибирование.

5. Методика исследования свойств сахаразы.

6. Методика исследования свойств амилазы.

7. Какие известны общие свойства ферментов и факторы, влияю­щие на скорость ферментативных реакций?

8. Какие существуют теории, объясняющие механизм действия ферментов?

9. Какие активаторы и ингибиторы ферментов известны?

То что у нас получилось в опыте 1