Стерилизация кипячением

Кипячение — способ стерилизации, гарантирующий обеспложивание при условии отсутствия в стерилизуемом материале спор. Применяют для обработки шприцев, инструментов, стеклянной и металлической посуды, рези­новых трубок и т. п.

Стерилизацию кипячением обычно проводят в стерили­заторе— металлической коробке прямоугольной формы с плотно закрывающейся крышкой. Стерилизуемый матери­ал помещают на имеющуюся в стерилизаторе сетку и заливают водой. Для повышения точки кипения и устране­ния жесткости воды добавляют 1—2% гидрокарбонат натрия (лучше пользоваться дистиллированной водой). Стерилизатор закрывают крышкой и подогревают. Нача­лом стерилизации считают момент закипания воды, время кипячения 15—30 мин. По окончании стерилизации сетку с инструментами извлекают за боковые ручки специаль­ными крючками, а находящиеся в ней инструменты берут стерильным пинцетом или корнцангом, который кипятят вместе с остальными инструментами.

Стерилизацию паром производят двумя способами: 1) паром под давлением; 2) текучим паром.

Стерилизацию паром под давлением производят в авто­клаве. Этот способ стерилизации основан на воздействии на стерилизуемые материалы насыщенного водяного пара при давлении выше атмос­ферного. В результате та­кой стерилизации при од­нократной обработке поги­бают как вегетативные, так и споровые формы микроорганизмов.

Автоклав — массивный котел, снаружи покрытый металлическим кожухом, герметически закрыт крышкой, которая плотно привинчивается к котлу откидывающимися болтами. В наружный ко­тел вставлен другой, меньшего диаметра, который называют стерилизационной ка­мерой. В эту камеру помещают предметы, подлежащие стерилизации. Между обоими котлами имеется свободное пространство, называемое водопаровой камерой. В эту камеру через воронку, укрепленную снаружи, наливают воду до определенного уровня, отмеченного на специаль­ной водомерной трубке. При кипячении воды в водопаро­вой камере образуется пар. Стерилизационная камера снабжена выпускным краном с предохранительным клапа­ном для выхода пара при повышении давления сверх необходимого. Для определения давления, создающегося в стерилизационной камере, служит манометр.

Нормальное атмосферное давление (760 мм рт. ст.) принимают за нуль. Между показаниями манометра и температурой имеется определенная зависимость (табл. 2).

В настоящее время имеются автоклавы с автоматиче­ским регулированием режима работы. Кроме обычного манометра, они снабжены электроконтактным маномет­ром, который препятствует увеличению давления выше заданной величины и тем самым обеспечивает постоянство нужной температуры в автоклаве.

Паром под давлением стерилизуют различные пита­тельные среды (кроме содержащих нативные белки), жидкости (изотонический раствор хлорида натрия, воду и т. д.); приборы, особенно имеющие резиновые части.

Температура и длительность автоклавирования пита­тельных сред определяется их составом, указанным в рецепте приготовления питательной среды. Например, простые среды (мясопептонный агар, мясопептонный бульон) стерилизуют 20 мин при 120 °С (1 атм). Однако при этой температуре нельзя стерилизовать среды, содер­жащие нативные белки, углеводы и другие легко изменя­ющиеся от нагревания вещества. Среды с углеводами стерилизуют дробно при 100 °С или в автоклаве при 112 °С (0,5 атм) 10—15 мин. Различные жидкости, приборы, име­ющие резиновые шланги, пробки, бактериальные свечи и фильтры стерилизуют 20 мин при 120 °С (1 атм).

Внимание! В автоклавах производят также обезвреживание инфи­цированного материала. Чашки и пробирки, содержащие культуры микроорганизмов, помещают в специальные металлические ведра или баки с отверстиями в крышке для проникновения пара и стерилизуют в автоклаве при 126 °С (1,5 атм) в течение I ч. Таким же образом стерилизуют инструменты после работы с бактериями, образующими споры.

К работе с автоклавом допускаются только специально подготовленные лица, которые должны строго и точно выполнять правила, указанные в инструкции, прилагаемой к аппарату.

Техника явтоклавирования. 1. Перед работой проверяют исправность всех частей и притертость кранов.

Через воронку, укрепленную снаружи котла, до верхней метки водомерного стекла заливают воду (дистиллированную или кипяченую, чтобы не образовалась накипь). Кран под воронкой закрывают.

В стерилизационную камеру на специальную сетку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует загружать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестериль­ными.

Резиновую прокладку на крышке натирают мелом для лучшей герметизации.

Крышку закрывают и болтами привинчивают к корпусу автокла­ва, причем болты закручивают попарно крест-накрест.

Открывают до отказа выпускной кран, соединяющий стерилиза­ционную камеру с наружным воздухом, и начинают нагревать автоклав. Нагревание автоклава обычно производят с помощью газа или электри­чества.

При нагревании автоклава вода закипает, образующийся пар подни­мается между стенками котлов и сквозь специальные отверстия, име­ющиеся в стенке внутреннего котла (см. рис. 12), попадает в стерилиза­ционную камеру и выходит через открытый выпускной кран. Сначала пар выходит вместе с воздухом, находившимся в автоклаве. Необходимо, чтобы весь воздух был вытеснен из автоклава, так как в противном случае показания манометра не будут соответствовать температуре в автоклаве.

Появление непрерывной сильной струи пара указывает на полное удаление воздуха из автоклава; после этого выпускной кран закрывают и давление внутри автоклава начинает постепенно повышаться.

Началом стерилизации считают момент, когда показания маномет­ра достигают заданной величины. Нагрев регулируют так, чтобы давление в автоклаве в течение определенного времени не изменялось.

По истечении времени стерилизации нагрев автоклава прекраща­ют, пар выпускают через выпускной кран. Когда стрелка манометра опускается до нуля, открывают крышку. Чтобы избежать ожогов паром, оставшимся в автоклаве, крышку следует открывать на себя.

Уровень температуры в автоклаве, т. е. правильность показаний манометра, можно проверить. Для этого используют различные веще­ства, имеющие определенную точку плавления: антипирин (113°С), резорцин и серу (119°С), бензойную кислоту (120 °С). Одно из этих веществ смешивают с ничтожно малым количеством красителя (фуксина или метиленового синего) и насыпают в стеклянную трубочку, которую запаивают и помещают в вертикальном положении между стерилизу­емым материалом. Если температура достаточна, вещество расплавится и окрасится в цвет соответствующего красителя.

Для проверки эффективности стерилизации в автоклав помещают пробирку с заведомо споровой культурой. После автоклавирования пробирку переносят в термостат на 24—48 ч, отмечают отсутствие или наличие роста. Отсутствие роста свидетельствует о правильной работе прибора.

Стерилизацию текучим паром производят в аппарате Коха. Этот способ применяют в тех случаях, когда стерилизуемый объект изменяется при температуре выше 100 °С. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие мочевину, углеводы, молоко, картофель, желатин и др.

Аппарат (кипятильник) Коха представляет со­бой металлический цилиндр, обшитый снаружи (для уменьшения теплоотдачи) войлоком или асбестом. Ци­линдр закрывают конической крышкой с отверстием для выхода пара. Внутри цилиндра находится подставка, до уровня которой наливают воду. На подставку ставят ведро с отверстием, в которое помещают стерилизуемый матери­ал. Нагревают аппарат Коха при помощи газа или элек­тричества. Отсчет времени стерилизации ведут с момента энергичного выделения пара у краев крышки и из отвер­стия для выхода пара. Стерилизуют в течение 30—60 мин. По окончании стерилизации нагрев прекращают. Вынима­ют из аппарата ведро с материалом и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Прогревание проводят 3 дня подряд при температуре 100 °С по 30— 60 мин. Такой метод носит название дробной стерили­зации. При первом прогревании гибнут вегетативные формы микробов, а споровые сохраняются. За сутки споры успевают прорасти и превратиться в вегетативные формы, которые погибают на второй день стерилизации. Так как возможно, что некоторая часть спор не успела прорасти, материал выдерживают еще 24 ч, а затем проводят третью стерилизацию. Стерилизация текучим паром в аппарате Коха не требует специального контроля, так как показателем правильной работы прибора служит стерильность приготовленных питательных сред. Стерили­зовать текучим паром можно также в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране.

Свертыватель Коха используют для свертывания сыво­роточных и яичных питательных сред, причем одновре­менно с уплотнением среды происходит ее стерилизация.

Свертыватель Коха представляет собой плоский метал­лический ящик с двойными стенками, покрытый снаружи теплоизоляционным материалом. В пространство между стенками через специальное отверстие, находящееся в верхней части наружной стенки, наливают воду. Отвер­стие закрывают пробкой, в которую вставлен термометр. Закрывают аппарат двумя крышками: стеклянной и метал­лической. Через стеклянную крышку можно наблюдать за процессом свертывания. Пробирки со средами укладыва­ют на дно свертывателя в наклонном положении.

Нагревание свертывателя осуществляют с помощью газа или электричества. Среды стерилизуют однократно при температуре 90 °С в течение 1 ч или дробно — 3 дня подряд при 80 °С в течение 1 ч.

Тиндализацию—дробную стерилизацию при низких температурах — применяют для веществ, которые легко разрушаются и денатурируются при температуре 60 °С (например, белковые жидкости). Прогревание стерилизу­емого материала производят на водяной бане или в специальных приборах с терморегуляторами при темпера­туре 56—58 °С в течение часа 5 дней подряд.

Пастеризация—стерилизация при 65—70 °С в течение 1 ч, предложена Пастером для уничтожения бесспоровых форм микробов. Пастеризуют молоко, вино, пиво, плодо­вые соки и другие продукты. Молоко пастеризуют с целью освобождения от молочно-кислых и патогенных бактерий (бруцеллы, микобактерии туберкулеза, шигеллы, сальмонеллы, стафилококки и др.). При пастеризации

пива, плодовых соков, вина погибают микроорганизмы, вызывающие различные виды брожения. Пастеризован­ные продукты лучше сохранять на холоду.

Стерилизация ультрафиолетовым облучением

Стерилизацию УФ-лучами производят при помощи специальных установок — бактерицидных ламп. УФ-лучи обладают высокой антимикробной активностью и могут вызвать гибель не только вегетативных клеток, но и спор. УФ-облучение применяют для стерилизации воздуха в больницах, операционных, детских учреждениях и т. д. В микробиологической лаборатории УФ-лучами обрабатыва­ют бокс перед работой.

Механическая стерилизация при помощи бактериальных фильтров

Стерилизацию фильтрованием применяют в тех случа­ях, когда стерилизуемые предметы изменяются при нагре­вании. Фильтрование проводят с помощью бактериальных фильтров, изготовленных из различных мелкопористых материалов. Поры фильтров должны быть достаточно мелкими (до 1 мкм), чтобы обеспечить механическую задержку бактерий, поэтому некоторые авторы относят фильтрование к механическим способам стерилизации.

Методом фильтрования стерилизуют питательные сре­ды, содержащие белок, сыворотки, некоторые антибиоти­ки, а также отделяют бактерии от вирусов, фагов и экзотоксинов.

В микробиологической практике используют асбесто­вые фильтры Зейтца, мембранные фильтры и фильтры (свечи) Шамберлана и Беркефельда.

Фильтры Зейтца представляют собой диски, изго­товленные из смеси асбеста с целлюлозой. Толщина их 3—5 мм, диаметр 35—140 мм. Отечественная промышлен- ность изготовляет фильтры двух марок: «Ф» (фильтру­ющие)— задерживающие взвешенные частицы, но пропу­скающие бактерии: «СФ» (стерилизующие) — с меньшими порами, задерживающие бактерии, но пропускающие ви­русы. Мятые асбестовые пластинки, а также пластинки с надломами и трещинами для работы непригодны.

Мембранные фильтры готовят из нитроцеллюло­зы. Они представляют собой диски белого цвета толщиной 0,1 мм и диаметром 35 мм. В зависимости от размера пор их обозначают № 1, 2, 3, 4 и 5 (табл. 3).

Для стерилизации наи­более пригоден фильтр № 1. Кроме перечислен­ных, выпускают еще так называемый предваритель­ный фильтр, предназна­ченный для освобождения фильтруемой жидкости от содержащихся в ней круп­ных частиц.

Фильтры (свечи)

Шамберлана и Берке- фельда представляют собой полые цилиндры, закрытые с одного конца. Свечи Шамберлана изготовляют из каолина с примесью песка и кварца. Стандартизуют их по размерам пор и обозначают Li, L₂, L3...L13. Фильтры (свечи) Беркефельда готовят из инфузорной земли, по величине пор их обозначают V, N, W, что соответствует диаметру пор 3—4, 4—7, 8—12 мк.

Работу с бактериальными фильтрами осуществляют следующим образом. Фильтр должен быть закреплен в специальном держателе, который вставляют в приемник фильтра. Приемником обычно является колба Бунзена. Держатели, в большинстве случаев сделанные из нержаве­ющей стали, состоят из двух частей: верхней, имеющей форму цилиндра без дна, и нижней — опорной части, заканчивающейся трубкой. Фильтры Зейтца шероховатой поверхностью вверх помещают на металлическую сетку и крепко зажимают винтами между верхней и нижней частью держателя. Смонтированный фильтр укрепляют в резиновой пробке, вставленной в горлышко колбы Бунзе­на. В отводную трубку колбы, которую присоединяют к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. Подготов­ленную установку обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм в течение 20—30 мин. Весь прибор в собранном виде называют также фильтром Зейтца.

Непосредственно перед филь­трованием отводной конец колбы Бунзена соединяют резиновой трубкой с масляным или водо­струйным насосом. Места соеди­нения различных частей заливают парафином для создания герме­тичности. В цилиндр аппарата на­ливают фильтруемую жидкость и включают в действие насос, соз­дающий вакуум в приемнике. В результате образующейся разно­сти давлений фильтруемая жид­кость проходит через поры филь­тра в приемник, а микробы оста­ются на поверхности фильтра.

Мембранные фильтры перед употреблением стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Чтобы предупре­дить скручивание фильтров, их сначала помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50— 60 °С, и кипятят на слабом огне 30 мин, 2 — 3 раза меняя воду. Держатель и приемник фильтра стерилизуют зара­нее, прибор монтируют в асептических условиях. Чтобы не порвать мембранный фильтр о металлическую сетку, под него кладут кружки стерильной фильтровальной бумаги. Затем стерильным пинцетом с гладкими кончика­ми берут мембранный фильтр из стерилизатора и помеща­ют на опорную сетку блестящей поверхностью вниз.

Простерилизованные в автоклаве свечи (Шамберлана) соединяют посредством резиновой трубки с приемником и опускают в сосуд (чаще цилиндр) с фильтруемой жидко­стью. Фильтрация происходит при помощи вакуумного насоса. В приемник поступает стерильный фильтрат, а бактерии задерживаются порами свечи.

Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование. Свечи после употребления кипятят в водопроводной воде, затем прокаливают в муфельной печи.

Перед последующим употреблением свечи проверяют на целостность. Свечу опускают в сосуд с водой и пропускают воздух. Если на поверхности свечи выступа­ют пузырьки воздуха, значит в свече образовались трещи­ны и она непригодна.

Химические способы

Этот вид стерилизации применяют ограниченно, и он служит в основном для предупреждения бактериального загрязнения питательных сред и иммунобиологических препаратов (вакцин и сывороток).

К питательным средам чаще всего прибавляют такие вещества, как хлороформ, толуол, эфир. При необходимо­сти освободить среду от этих консервантов ее нагревают на водяной бане при 56 °С (консерванты испаряются).

Для консервирования вакцин, сывороток пользуются мертиолатом, борной кислотой, формалином и т. д.

Биологическая стерилизация

Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков. Этот метод используют при культивирова­нии вирусов.