Простой метод окраски

Препарат помещают на подставку для окраски, иссле­дуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3—5 мин, фуксином Пфейффера—1—2 мин.

На окрашенный и высушенный препарат наносят кап­лю иммерсионного масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Сложные методы окраски

Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.

В зависимости от результатов окраски все микроорга­низмы делят на две группы — грамположительные и грамотрицательные.

Грамположительные бактерии содержат в кле­точной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолето­вым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.

Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магни­евой соли РНК. Под действием спирта краситель вымыва­ется, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополни­тельным красителем (фуксином) в красный цвет.

1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1—2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.

2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.

3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30—60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1—2 с.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промы­вают водой и высушивают.

Окраска по Цилю — Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий). Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бакте­рии

к и с л о т о-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.

Фиксированный препарат покрывают фильтроваль­ной бумагой и наносят Фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.

Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кис­лоты, погружая 2—3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.

Окрашивают водно-спиртовым раствором метилено­вого синего в течение 3—5 мин, промывают водой и высушивают.

Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в крас­ный цвет, остальные — в синий.

Окраска по Ожешко (выявление спор).

1. На высушен­ный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.

2. Окрашивают по способу Циля — Нильсена. Кисло­тоустойчивые споры окрашиваются в розово­красный, а бактериальная клетка — в голубой цвет.

Окраска по Бурри — Гинсу (выявление капсулы). Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры.

Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.

Фиксируют химическим способом спиртом или суле­ек мой. Осторожно промывают водой.

Окрашивают фуксином Пфейффера 3—5 мин. Осто­рожно промывают и высушивают на воздухе.

Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.

Изучение подвижности микроорганизмов

Для исследования используют культуру бактерий, вы­ращенных в жидкой питательной среде, или взвесь бакте­рий в изотоническом растворе натрия хлорида.

Метод раздавленной капли. На предметное стекло наносят пипеткой каплю культуры и покрывают ее пок­ровным стеклом. Чтобы не образовывалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения препарата от высыхания его помещают во влажную камеру.

Влажная камера представляет собой чашку Петри, на дне которой находится влажная фильтровальная бума­га. На бумагу кладут две спички и на них помещают препарат. Чашку закрывают крышкой.

Микроскопируют при увеличении объектива 40х в темном поле.

Метод висячей капли. Для приготовления препарата необходимы стекло с лункой, покровное стекло и вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина.

На покровное стек­ло наносят каплю культу­ры. Затем осторожно на­крывают покровное стек­ло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. Склеившиеся стек­ла быстро переворачивают покровным стеклом вверх.

Капля находится в герме­тической камере и сохраняется долгое время. При микроскопии сначала при малом увеличении (8х) находят край капли, а затем проводят изучение препарата при большом увеличении.