1.3 Особенности ультраструктуры некультивируемых форм микроорганизмов

Для изучения ультраструктурных особенностей покоящихся клеток широко используется метод электронной микроскопии. В некультивируемых клетках бактерий происходят существенные морфологические изменения по сравнению с нормально развивающимися клетками, что связано с приспособлением к неблагоприятным условиям среды обитания. Клетки в некультивируемом состоянии обычно имеют значительно меньший размер и кокковую форму (Пушкарева c соавт, 1997; Tholozan et. al, 1999). У разных видов Vibrio после двух недель голодания размер клеток редуцирует до 1 мкм (Novitsky, Morita, 1977). Некультивируемые клетки M. tuberculosis, имеющие палочковидную форму на экспоненциальной фазе роста, в длительной пост-стационарной фазе представлены овоидными и коккоидными формами небольшого размера (0,6 – 0,8 мкм) с неповрежденной клеточной стенкой и дыхательной активностью, близкой к нулю, что позволяет рассматривать эти формы как покоящиеся (Шлеева с соавт, 2003).

Исследованы микробные сообщества грунтов вечной мерзлоты и нефтешламов. Обнаружено, что в грунтах вечной мерзлоты большинство микроорганизмов представлено покоящимися (анабиотическими) формами – цистоподобными клетками с характерными органо-минеральными покровами. Большинство клеток заключены в крупные капсулярные слои (Дмитриев с соавт, 2004).

Морфологические изменения в бактериальных клетках широко изучены на культурах бактерий при их длительном инкубировании на средах, лимитированных по какому-либо из минеральных элементов. Структурные изменения, сопровождающие переход вегетативных клеток в покоящиеся формы, носят комплексный характер и затрагивают оболочку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму и нуклеоид. Сравнительный анализ покоящихся клеток Micrococcus luteus, Arthrobacter globiformis, Pseudomonas aurantiaca культивируемых в средах, лимитированных по источникам азота, фосфора и углерода, выявил особенности ультраструктурной организации покоящихся клеток. Эти клетки характеризовались наличием сплошного толстого слоя микрокапсулы, состоящего из электронно-плотного фибриллярно-гранулярного материала, увеличением толщины и слоистости клеточной стенки, измененной структурой цитоплазмы, конденсированным нуклеоидом. Для клеток Pseudomonas aurantiaca характерно также увеличение периплазматического пространства и наличие мелкогранулярной цитоплазмы без четко выраженных рибосом (Сузина с соавт, 2004).

Для клеток A. globiformis 245, находящихся в состоянии анабиоза, характерно снижение электронной плотности цитоплазмы, слабая выраженность области нуклеоида, утолщение клеточной стенки (Мулюкин с соавт, 2001). В связи с наличием определенных ультраструктурных особенностей покоящиеся клетки Arthrobacter globiformis отличались термоустойчивостью (Демкина с соавт, 2000).

4. Способы переживания неблагоприятных условий бактериями

Микроорганизмы способны гибко адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, в том числе к недостатку питательных веществ. Хорошо изучено образование эндо- и экзоспор у спорообразующих бактерий. Некоторые бактерии образуют шарообразные толстостенные клетки, называемые цистами. Для неспорообразующих бактерий долгое время считалось, что клетки, утратившие способность к делению, являются мертвыми. На сегодняшний день известно, что у большинства изученных микроорганизмов потеря пролиферативной активности еще не свидетельствует об их гибели.

Покоящиеся формы микроорганизмов. Микроорганизмы, не образующие спор, а также спорообразующие бактерии, культивируемые в неблагоприятных условиях способны образовывать покоящиеся формы – формы или стадии развития с резко сниженным обменом веществ и энергии. У покоящихся форм отсутствуют рост и размножение, они не выделяют токсинов, экзоферментов, других биологических веществ, более устойчивы к различным повреждающим факторам внешней среды (в том числе к антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам, температуре) и иммунным факторам организма-хозяина. Такие формы способны долгое время переживать во внешней среде или в организме хозяина (Ильинская, 2006). Покоящиеся клетки, как правило, изменяют свою форму, утолщают клеточную стенку и становятся менее чувствительными к агрессивным внешним воздействиям (Пахомов, 2010).

Некультивируемое состояние бактерий. В настоящее время хорошо известно, что в ответ на стрессовые условия окружающей среды бактерии способны переходить в состояние покоя, или так называемое "некультивируемое состояние" (НС), характеризующееся резко сниженной метаболической активностью и временной потерей способности к размножению.

Переход в некультивируемое состояние может быть вызван различными стрессовыми факторами и в некоторых случаях является штаммоспецифичным свойством. Переходя в НС, микроорганизмы часто уменьшаются в размерах. Метаболизм клеток в НС претерпевает серьезные изменения – снижается уровень трансмембранного транспорта, дыхания и синтеза макромолекул. Несмотря на неспособность к образованию колоний клетки могут синтезировать токсины, некоторые виды сохраняют способность к адгезии на клетках человека в культуре ткани с последующим возвратом в культивируемое состояние. Судя по цитохимическим реакциям на начальных стадиях НС имеет место преобладание количества РНК над ДНК, сохраняются некоторые проявления метаболической активности – утилизация глюкозы, восстановление метиленового синего в лейкоформу, что свидетельствует о частичном функционировании окислительно-восстановительных метаболических реакций. Степень сохранения метаболической активности у разных видов, перешедших в НС, колеблется в широких пределах. Переход в некультивируемое состояние может также определяться возрастом культуры и стадией развития инфекционного процесса. Показано формирование покоящихся клеток культурой Mycobacterium tuberculosis как результат длительного постстационарного инкубирования. Клетки M. tuberculosis в старых культурах in vitro, находящихся в герметичных сосудах без перемешивания при 37 °С, сохраняли жизнеспособность в течение 12 лет в условиях голодания (Corper, 1933). Образование обширных некрозов на растениях, инфицированных R. solanacearum, сопровождаелось переходом около 99% клеток патогена в НС (Grey, Steck, 2001).

Существует две точки зрения на сущность НС. Первая основана на представлении о том, что это дегенеративный процесс – поэтапная перестройка метаболизма вегетативной клетки вплоть до её гибели. Этой точке зрения не противоречит представление о том, что НС является проапоптозом. Суть второй точки зрения – переход в НС рассматривается как запрограммированный физиологический ответ, обеспечивающий переживание клеток в потенциально летальных стрессовых условиях, то есть адаптация микроорганизма к стрессовым условиям. Таким образом, отсутствует единство взглядов на физиологическую сущность НС, и хотя большинство исследователей разделяет вторую точку зрения, не исключено, что эти различающиеся точки зрения не альтернативны (Ильинская, 2006).