5. Методы генной инженерии в животноводстве. Получение трансгенных животных.

Методы генной инженерии имеют большие перспективы в животноводстве:

• повышение продуктивности;

• повышение резистентности к заболеваниям;

• увеличение скорости роста;

• улучшение качества продукции.

Трансгенные животные – это животные, несущие в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген. Продукт этого гена будет называться трансгенным. Благодаря этому гену у животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве.

Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов:

А. Приготовление ДНК для микроинъекции.

Б. Извлечение эмбрионов у доноров.

В. Микроинъекция ДНК.

Г. Пересадка инъекцированных эмбрионов в яйцеводы реципиентов.

Микроинъекция ДНК – наиболее распространенный метод трансформации генов в геном животных. Это делают с помощью пипетки (d =1мкм). Микроинъекции эмбрионов мышей, кроликов проводят легко, труднее идут работы с эмбрионами сельскохозяйственных животных. Каждому реципиенту в яйцеводы помещают 20-30 инъекцированных зигот (кролики, свиньи) или 2-4 зиготы (крупный рогатый скот). К сожалению, передача трансгена по наследству затруднена.

Значение работ:

1.Получение животных-биореакторов, т.е. производителей ценных БАВ (гормон роста, инсулиноподобный гормон). Гормон роста у крупного рогатого скота вызывает прибавление массы, увеличение удоев, уменьшение содержание жира и, как следствие, улучшение качества мясопродуктов.

2.Получение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Результаты в этой области – невелики. У животных мощным защитным механизмом является иммунная система и ряд генов резистентности. Ведутся работы по внедрению подобных генов в геном животных (от мышей к свиньям). Получены трансгенные куры, устойчивые к лейкозу.

Следует отметить, что выращивание трансгенных животных и их обслуживание – дорогие и сложные процедуры. Но такие животные являются продуцентами белков с низкой стоимостью. Примеры:

• В Москве, в институте животноводства получили трансгенную овцу с геном химозина (сычужный фермент коров), т.е. овца дает молоко с ферментом, необходимым для производства сыра. Обычно этот фермент добывали из истолченного телячьего желудка (ради этого убивали телят). А теперь, при новой технологии 200 овец могут обеспечить сыром всю Россию.

• Сейчас ведутся работы по увеличению мясистости лосося (трансгенная рыба в 2 раза крупнее, но, к сожалению, конкурирует с обычным лососем); со свиньями по двум направлениям: улучшение мясистости и получение организмов, пригодных для трансплантации органов для человека.

6. Использование генной инженерии в медицине.

6.1 Получение ряда белков.

А. Получение инсулина.

Инсулин уже давно получают из органов животных, однако многолетнее применение животного инсулина ведет к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного вещества. Но даже при этом потребности удовлетворялись всего на 60-70% (из 6 млн. больных только 4 млн. получали инсулин).

Начиная с 1982 г. в США, Японии, Великобритании производят генно-инженерный инсулин. Из 1000 л. бактериальной культуры получают 200 гр. инсулина (такое количество можно получить из 1600 кг. поджелудочных желёз животных).

Технология получения генно-инженерного инсулина проста. ДНК человека, содержащую искомый ген, режут рестриктазами и помещают в плазмиду. Рекомбинантную плазмиду помещают в бактерию E.coli, которая начинает продуцировать белок инсулин.

Б. Синтез соматотропина.

Соматотропин, или гормон роста, синтезируется передней долей гипофиза; его недостаток ведет к гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Обычно его получали из гипофиза трупов. Препарат из трупного материала представлял собой смесь гормонов и у 30 % больных против него вырабатывались антитела, что сводило на нет его биологическую активность.

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время гормон синтезируют методами генной инженерии в клетках бактерии E.coli.Получаемый гормон содержит на конце молекулы остаток метионина и обладает значительной биологической активностью. Однако после крупномасштабных проверок на токсичность, запущен в широкое производство.

В. Получение интерферонов.

Интерфероны были открыты в 1957 г. в Лондоне как факторы устойчивости к вирусной инфекции: они препятствуют размножению вирусов в клетке. Известны три группы:

-α- интерфероны: образуются при воздействии вирусов на лейкоциты;

-β-интерфероны: образуются при воздействии на фибробласты (участвуют в заживлении ран);

-γ- интерфероны: вырабатываются Т-лимфоцитами в ответ на действие антигенов бактериального и вирусного происхождения.

Все интерфероны – гликопротеины. Они используются для лечения вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы, опухолей гортани, легких, мозга.

Традиционно интерфероны получают из крови человека (1 л. крови – 1 мкг. интерферона, т.е. примерно на одну дозу инъекции): выход низкий, препарат недостаточно чистый и дорогой. На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генной инженерии. Сложность в том, что этот белок синтезируется к клетке в виде предшественников, т.е. содержит на конце пептид. Бактерии, синтезирующие интерферон, не имеют ферментов, способных отщеплять пептид при выходе из клетки. Синтезированный генно-инженерный интерферон был выделен, очищен и его свойства оказались близкими свойствам интерферона, полученного из крови. Сейчас 1 л. бактериальной культуры E.coli дает 5 мг. интерферона, что в 5000 раз больше того, что можно получить естественным способом. К сожалению, бактерия не может осуществить гликозирование (интерфероны-гликопротеиды). В настоящее время гены интерферонов клонированы в дрожжи и клетки высших эукариот, способных осуществлять гликозирование.

На данный момент 200 диагностических препаратов, полученных методом генной инженерии, уже введены в медицинскую практику и более 100 находятся на стадии испытания.

Дополнительная информация:

• Достижения генной инженерии в комбинации с обычными средствами облучения, использующиеся для лечения онкологических заболеваний, могли бы значительно повысить шансы на исцеление больных, страдающих определенными видами рака. Новый метод позволяет изменять раковые клетки до такой степени, что они становятся очень чувствительными к разрушающему действию лучей. Окружающие здоровые клетки при этом не страдают.

6.2 Генотерапия.

Неблагоприятная экологическая обстановка и другие причины приводят к тому, что все больше детей рождается с серьезными наследственными заболеваниями. Открытия ученых позволили выяснить, что размер генома человека невероятно велик (около 3,2 млрд. нуклеотидов) и считывание такого количества «букв» невозможно без неких ошибок. Эти ошибки дают начало мутациям, которые приводят к одному из трех последствий:

• Смерть организма.

• «Дефектная» жизнь организма.

• Могут быть безразличными для организма.

В настоящее время известно около 4000 наследственных заболеваний и для большинства из них не найдено эффективных способов лечения. Хотя разработаны диагностические препараты, позволяющие обнаружить генетические аномалии в период беременности (1 % новорожденных имеют генетические заболевания, которые приводят к физическим и умственным отклонениям, смерти).

Дополнительная информация:

• ТКИД – тяжелый комбинированный иммунодефицит. Иммунная система при этом заболевании – отключена. Дети не доживают до года. В США известен такой больной – мальчик Давид. Информация о нем засекречена. Только при рождении он дышал атмосферным воздухом 5 минут. Он постоянно находится в герметичной камере, передвигается при помощи специальной системы, ему опасны даже бактерии ротовой полости и кишечника. На данный момент о его судьбе ничего не известно.

В 1989 г. в США предпринята попытка применить генотерапию для лечения ТКИД. Суть генотерапии – замена дефектного гена. Возможны два подхода:

1) В соматические клетки вводят нормальный ген и он, при рекомбинации гомологичных хромосом, заменит дефектный. Сложность этого метода в том, что проконтролировать ДНК в клетке трудно: на одно правильное встраивание приходится 1000 случайных.

2) В клетку вводят нужный ген, который не заменяет дефектный, а компенсирует его функцию, встраиваясь в хромосому в другом месте.

По основным подходам в реализации целей генной терапии выделяют соматическую (объект – соматические клетки) и фетальную генную терапию (объект – клетки плода). Однако работы по генной инженерии человека ограничены в основном соматическими тканями, поскольку манипуляции на половых или зародышевых клетках могут привести к серьезным и непредсказуемым последствиям.

В настоящее время практически все клинические исследования сосредоточены на втором способе, т.е. внесение дополнительных генов, а не на коррекции или замещении генов. В любом случае ген должен быть доставлен в клетку – мишень. Сложность процедуры генотерапии в том, что не найден универсальный вектор – переносчик генов. Чаще всего используют ретровирусы, которые способны заражать все клетки. Но ретровирусы обладают высокой патогенной активностью (могут активировать онкогены) и осложняют эффект от генотерапии.

Другая проблема – это создание условий для нормального функционирования доставленного в клетку гена (его экспрессии). Эта проблема до настоящего времени не решена и продолжает оставаться центральной проблемой генотерапии. Трудность достижения этой цели можно выразить словами американского ученого Ф. Андерсона: «Организм человека затратил много тысяч лет, чтобы защитить себя от нападения факторов внешней среды, в том числе от чужеродной ДНК, пытавшейся проникнуть в его геном». Поэтому, попавший в клетку нужный ген мгновенно распознается как чужой, и она пытается избавиться от него. Таким образом, «вылечить» удается только часть клеток и только на время.

Еще одно серьезное препятствие на пути применения генной терапии – мультигенная природа многих заболеваний, т.е. их обусловленность более чем одним геном.

По мнению специалистов, преимущество генной терапии по сравнению с другими видами лечения заключается в том, что она направлена на устранение причин заболевания, в то время как большинство лекарств устраняет лишь симптомы болезни. Во многих странах генотерапию считают приоритетным направлением в науке и финансируют, прежде всего.

Но обязательным требованием генной терапии является проведение предварительных экспериментальных исследований на животных. Для разрешения клинических испытаний необходимо доказать в экспериментах на животных, что:

А) Нужный ген может быть перенесен в соответствующие клетки – мишени, где он будет функционально активен длительное время.

Б) Нужный ген в новой среде не потеряет свою экспрессию, т.е. сохранит эффективность.

В) Такой перенос не вызовет неблагоприятных последствий в организме.

История генотерапии – молода, клинические испытания начаты в 1990 году. Несмотря на то, что еще не получено ни одного окончательного клинического результата, можно констатировать, что эра генотерапии уже началась. Определены принципы и подходы, отобраны потенциальные болезни для этого лечения.

6.3 Евгеника.

Евгеника – учение о наследственном здоровье человека и путях его улучшения. Принципы евгеники были сформулированы в 1869 году Ф.Гальтоном. Он предложил изучать влияния, которые могут улучшать наследственные качества (здоровье, умственные способности, одаренность). На многих ученых-биологов эти идеи произвели воздействие. Они пришли к выводу, что человеческому виду следует заняться своим улучшением и для этого поддерживать воспроизводство людей, обладающих желаемыми качествами (позитивная евгеника), и препятствовать воспроизводству больных, умственно отсталых, калек (негативная евгеника). Интерес к евгеническим идеям был особенно силен в 20-х годах 20 века. Многие прогрессивные генетики ставили перед евгеникой гуманные задачи, однако ее идеи нередко использовались для оправдания расизма. В Германии евгеника стала называться «расовой гигиеной» и все известные события отечественной войны дискредитировали не только евгенику как научную дисциплину, но сам термин «евгеника».

Проблема человека и его здоровья на рубеже третьего тысячелетия приобрела особую актуальность. Повышение уровня радиации, экологические яды, мутагены, канцерогены в окружающей среде – все эти и другие факторы способствуют накоплению вредных мутаций, и, как следствие, ведут к ухудшению здоровья, различным психическим отклонениям, патологиям. Полноценное существование человека, обеспечение его здоровья и максимальной продолжительности жизни оказываются под угрозой. Так вновь возникают евгенические вопросы: нельзя ли избежать рождения больных и неполноценных людей или улучшить человеческую породу с помощью высокотехнологичных средств биологической науки? Но, если традиционная евгеника говорит об улучшении человеческой породы путем селекции, то возникающая сейчас неоевгеника предполагает вмешательство в наследственный аппарат человека на уровне макромолекул и клеток, т.е. с помощью генной инженерии. Уже сейчас, на нынешнем уровне знаний о геноме человека теоретически вполне возможны такие его модификации с целью улучшения некоторых физических (рост), интеллектуальных и психических параметров. Хотя неоевгеника поднимает ряд вопросов, на котрые вряд ли можно ответить:

Какова природа наследственности, которую природа стремиться трансформировать?

Насколько успешно и какими способами можно ее изменить?

На какие цели должна ориентироваться евгеника и какими методами можно этого достигнуть?

Вообще любое усовершенствование начинается с разделения на плохое и хорошее, жизнеспособное и слабое, талантливое и бездарное. На уровне человеческого общества такой отбор неизбежно порождает дискриминацию. Поэтому в цивилизованном обществе евгенические проекты являются утопическими. Реализация евгенических идей означает генетическую катастрофу для человечества. Ситуация складывается так, что с развитием передовых генных технологий все меньше принимается всерьез сам эмбрион, его право на жизнь, т.е. обесценивается сам человек. Сегодня уже существуют методики, позволяющие выбирать пол ребенка (80 % успеха). Если такое положение вещей установится, то это может привести к нарушению между полами, особенно в тех странах, где женский пол традиционно считается «худшим» полом.

Появившиеся методы пренатальной диагностики позволяют выявлять генетические дефекты умственного развития еще до появления младенца. Многие считают, что данные методы ни в коем случае нельзя применять для отбора эмбрионов по интеллекту. Ведь никто не гарантирует, что высокоинтеллектуальные субъекты не будут ущербны в чем-то другом. Поэтому человечеству безопаснее пользоваться дарами природы – появление на свет всяких людей, в т.ч. гениев или просто талантливых людей.

Конечно «здоровое ядро» евгеники может и должно развиваться. Цели молекулярной антропогенетики и медицинской генетики – освободить человека от вредных наследственных заболеваний.

Лекции 4 – 5