Антимутагены

Важная особенность антимутагенов — стабилизация мутацион­ного процесса до естественного уровня. Вещества с антимутаген­ными свойствами характеризуются способностью с различной степенью эффективности снижать уровни мутабильности. Им при­суща такая характеристика, как физиологичность действия. Дело в том, что, проявляя антимутагенные свойства в низких концентра­циях, некоторые из этих веществ в высоких дозах могут действо­вать как мутагены, например аргинин, глутаминовая кислота, си-линит натрия, стрептомицин, производные галловой кислоты.

Как показали наши исследования, передозировка витамина D2 при добавке его быкам привела к нарушению спермиогенеза. Генотоксическое действие выражалось в азоспермии и некро-спермии. Нами также установлено, что гипервитаминоз D стал

175

причиной развития врожденной аномалии у крупного рогатого скота, получившей название «синдром гиены». У этих животных отмечено повышение уровня аберраций хромосом и сестринских хроматидных обменов. Вместе с тем повышение концентрации других антимутагенов (токоферола, каротина, филлохинона и др.) не изменяет их действия.

Отдельные мутагены характеризуются специфичностью дейст­вия — они эффективны только по отношению к аберрациям хро­мосом или генным мутациям.

Механизм действия антимутагенов связывают с нейтрализа­цией мутагена до его взаимодействия с ДНК; предотвращением образования в процессе метаболической активности мутагенных продуктов из нетоксичных предшественников; активацией фер­ментных систем детоксикации поступающих из среды загрязни­телей; предотвращением ошибок в процессе репликации ДНК; активацией репарации и других внутриклеточных систем поддер­жания целостности генетического аппарата.

Установлено, что способностью снижать частоту мутаций обла­дают более 200 природных и синтетических соединений. Одна из наиболее изученных групп антимутагенов — витамины и провита­мины. Так, витамин Е (токоферол) в значительной степени снижа­ет мутагенное действие ионизирующих излучений и химических соединений, а также блокирует генотоксическое действие вирусов.

Хорошо изучен другой жизненно важный антимутаген — вита­мин С (аскорбиновая кислота). Введение этого витамина в раци­он способствует уменьшению частоты аберраций хромосом, вы­званных ионизирующими излучениями.

Витамин А (ретинол) и его предшественник — каротин, со­держащийся в растениях, снижают естественное и искусственное мутирование в клетках у животных, особенно вызванных дейст­вием промышленных загрязнений.

Известны также антимутагенные свойства витамина Ki (фил­лохинона). Животные, получающие в дополнение к обычному рациону филлохинон, лучше противостоят генотоксическому действию различных мутагенов промышленного происхождения.

Экспериментально показано антимутагенное действие пара-аминобензойной кислоты — предшественника фолиевой кислоты (витамина В), введение которой приводило к снижению дейст­вия алкилирующих соединений, ультрафиолетового и гамма-об­лучения путем усиления репарации.

Вторая группа соединений с выраженными антимутагенными свойствами — это отдельные аминокислоты (аргинин, гистидин, метионин, цистеин и др.).

Третью группу антимутагенов составляют некоторые ферменты (пероксидаза, НАДФ-оксидаза, глутатиолпероксидаза, каталаза и

ДР-)-

К четвертой группе антимутагенов можно отнести отдельные

176

фармакологические средства (интерферон, сульфаниламиды, гек-самидин, препараты фенотиазивного типа и др.).

Среди антимутагенов выделяют большую группу веществ, об­ладающих антиокислительными свойствами (производные галло­вой кислоты, ионол, оксипиридины, дигидропиридины и др.), а также группы комплексных соединений, входящих в состав раз­личных продуктов растительного и животного происхождения.

Таким образом, накопление мутагенов в биосфере поставило перед человечеством серьезную задачу разработки методов и под­ходов по защите генетического аппарата (ДНК) как самого чело­века, так и многочисленных форм и сообществ живой материи, обитающих на Земле. В противном случае мутационные измене­ния могут привести к самым тяжелым последствиям, вплоть до полного вымирания видов. Основные пути снижения концентра­ций вредных веществ в биосфере следующие: создание безотход­ных технологий, замкнутых циклов производства в промышлен­ности; переход от химических средств борьбы в сельском хозяйст­ве на безвредные биологические; создание устойчивых сортов растений, не требующих химических средств защиты, или без­опасных с генетической точки зрения пестицидов; повышение естественной резистентное™ животных путем биологизации тех­нологий кормления и содержания, выращивания молодняка; пле­менная работа, направленная на создание генетически устойчи­вых к болезням пород, линий, гибридов. Это будет ограничивать применение фармакологических средств, а также вакцин и сыво­роток. В перспективе все более широкую основу могут иметь узконаправленные вакцины, полученные генно-инженерным путем; выявление мутагенов в окружающей среде и их изъятие (компонентный подход). Хотя это и непросто, однако этот путь тоже будет применяться для снижения их воздействия на геном животных. Использование антимутагенов для снижения темпов мутирования, так называемый компенсационный подход, — наи­более реальное средство для защиты ДНК от необратимых изме­нений.

В селекционном плане актуальными задачами становятся вы­явление животных с нестабильными геномами и их браковка и отбор для воспроизводства особей со стабильными малочувстви­тельными к экстремальным факторам среды геномами.

Контрольные вопросы. 1. Что такое мутации и мутагенез? 2. Какие мутации наследуются и какие нет? 3. Каковы классификация и определения разных типов числовых и структурных аберраций хромосом? 4. Каковы возможные причины и механизмы образования хромосомных мутаций? 5. В чем состоит молекулярный механизм генных мутаций и характер их влияния на биосинтез белка? 6. Что такое спонтанные и индуцированные мутации? 7. Какова роль репарирующих систем в мутационном процессе?

Г лава 11 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ОНТОГЕНЕЗА

Онтогенез — непрерывный процесс количественных и качествен­ных изменений, происходящих в организме в течение всей жизни при постоянном взаимодействии генотипа и условий среды.

Термины «онтогенез» и «филогенез» ввел в биологию немец­кий зоолог Е. Геккель. Он же сформулировал и обосновал (1866) биогенетический закон. Термин «онтогенез* означает процесс индивидуального развития особи, «филогенез* — история разви­тия вида. Согласно биогенетическому закону индивидуальное развитие особи (онтогенез) является как бы кратким повторени­ем (рекапитуляцией) филогенеза. А. Н. Северцов считает, что под филогенезом следует понимать ряд исторически отобранных онтогенезов. Филогенез реализуется в онтогенезе через наследст­венность, составляет основу онтогенеза и направляет онтогенез по пути, пройденному предками. В зиготе (оплодотворенной яйцеклетке) содержится записанная в структуре молекул ДНК генетическая информация о развитии будущего организма. В процессе онтогенеза происходит реализация генетической ин­формации в определенных условиях среды.

Онтогенез животных включает два основных взаимосвязанных процесса — рост и развитие. Под ростом понимают процесс увели­чения размеров организма, его массы, происходящий за счет на­копления в нем активных, главным образом белковых, веществ. В основе роста лежит увеличение числа и размеров клеток и некле­точных образований. Под развитием понимают качественные из­менения — процессы усложнения структуры организма, специали­зацию, дифференциацию и интеграцию его органов и тканей.

Одна из основных проблем биологии — выяснение вопроса: каким образом из одной-единственной клетки возникает множе­ство разнообразных типов клеток, значительно различающихся между собой строением, функцией, и как в процессе онтогенеза идет становление признаков и свойств организма? Проблема изучения механизма генетического контроля онтогенеза имеет не только теоретическое, но и практическое значение для успешно­го решения таких вопросов, как селекция животных и растений, профилактика и лечение генетически обусловленных болезней у животных и человека.

178

РАСКРЫТИЕ СЛОЖНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНА

В соответствии с представлениями классической генетики долгое время считалось, что ген — неделимая единица функции, рекомбинации и мутирования. Гены представлялись как бусин­ки, механически соединенные каким-то материалом в хромосо­ме. Вопрос о пересмотре представлений о гене как неделимой единице впервые был поставлен в 1929—1930 гг. А. С. Серебров-ским с сотр. Они изучили мутации гена scute (скьют), влияюще­го на развитие щетинок на теле дрозофилы, и обнаружили явле­ние ступенчатого аллелизма. Было выявлено 14 мутаций гена scute: SCi, SC2, SC3 и т. д. Мутации отличались друг от друга редукцией щетинок на определенных участках тела: в одном случае не было щетинок на голове и предгруди, в другом — на предгруди и груди и т. д. Мы уже знаем, что при скрещивании особей с разными аллельными генами у потомков имеет место доминирование одного из них. В случае же серии аллелей гена scute у гетерозиготных особей был обнаружен частичный возврат к норме. У гетерозиготных потомков не развивались только те щетинки, которых не было у обоих родителей. Щетинки разви­вались нормально, если изменение наблюдалось только в одном из аллельных генов. Если, например, мутация SQ вызывала редукцию щетинок ABC, а мутация SC2 — редукцию щетинок BCD, то у гетерозиготы отсутствовали щетинки В и С и развива­лись нормально А и D. При графическом изображении взаимо­действия несколько пар аллеломорфов получается как бы лест­ница, ступенями которой служат отдельные аллели гена scute (скьют): SCi — ABC; SC2 — BCD; SC₃ — CDE.

Это явление получило название ступенчатого аллеломорфизма. Было показано, что ген не является единицей мутации, он дро­бим и имеет сложную структуру.

На основании проведенных исследований была сформулиро­вана центровая теория гена. Согласно ей ген состоит из отдельных функциональных участков — центров, которые могут независимо изменяться при мутациях.

Глубокие исследования тонкой структуры генов фага Т4, по­ражающего кишечную палочку, были проведены американским генетиком С. Бензером. Дикий тип фага Т4 лизирует разные штаммы кишечной палочки, в том числе штаммы В и К. При этом в бактериальных культурах наблюдается появление мелких стерильных пятен. При посеве фага на штамм В были обнаруже­ны и отобраны мутанты фага, названные rll (г — от англ. rapid, lysis — быстрый лизис), образующие крупные стерильные пятна (по сравнению с фагом дикого типа) и не способные размно­жаться на штамме К (не образуют стерильных пятен). Для ана­лиза выявленных мутантов С. Бензер разработал тест на компле-ментарность, который заключается в следующем: если бактерии

179

штамма К заразить смесью двух разных мутантов rll и это не приведет к лизису клеток штамма К, значит,- мутации у обоих фагов затрагивают одну и ту же функцию и произошли в одном и том же гене. Если же при совместном заражении восстанавли­вается дикий тип, т. е. произойдет лизис клеток штамма К, значит, мутации комплементарны и произошли в разных генах. С. Бензер исследовал попарно очень большое число мутантов rll и установил, что они принадлежат к двум функциональным группам: А и В. Любой из мутантов группы А комплементарен любому из мутантов группы В, в то же время два мутанта, относящиеся к одной и той же группе А или В, некомплементар­ны, они затрагивают одну и ту же функциональную единицу, и в этом случае сохраняется мутантный фенотип. Наличие двух классов мутантов привело к выводу о существовании двух функ­циональных единиц в пределах rll генома фага Тф Каждая из этих единиц связана, очевидно, с синтезом специфического полипЙЬтида, необходимого для роста на штамме К. Генетичес­кая единица функции, выявленная с помощью теста на компле-ментарность, была С. Бензером названа цистроном. В настоящее время термин «цистрон» используется как синоним гена.

Геном называется участок молекулы ДНК (у некоторых вирусов РНК), кодирующий первичную структуру полипептида, молекулы транспортной или рибосомной РНК или взаимодействующий с регу-ляторным белком.

Структурной единицей мутации и рекомбинации гена являет­ся одна пара нуклеотидов (или один нуклеотид в случае геномов, состоящих из одноцепочных ДНК или РНК). Для обозначения локализации мутаций в пределах гена применяется термин «сайт». Сайт может включать одну пару нуклеотидов, а в неко­торых случаях, возможно, и больше. Размер генов в разных организмах различен, однако в среднем ген включает 1500 пар нуклеотидов. Самые короткие — гены, кодирующие тРНК. Они включают приблизительно 190 пар нуклеотидов. Но имеются и очень длинные гены. Например, ген фиброина шелка тутового шелкопряда включает 16 тыс. пар нуклеотидов. Таким образом, ген — очень сложная структура.

Установлено, что молекулярное строение генов эукариот отличается от генов прокариот. У последних гены представляют собой непрерывную последовательность триплетов, обеспечи­вающих кодирование колинеарной последовательности ами­нокислот в определенной полипептидной цепи. У эукариот многие гены имеют мозаичную структуру. Оказалось, что они составлены из кодирующих участков — экзонов, разде­ленных некодирующими участками — интронами. Например, в генах тяжелой цепи иммуноглобулинов не менее пяти экзонов и четырех интронов, в гене овальбумина (яичного белка) восемь экзонов и семь интронов.

180

В последние годы у прокариот обнаружены перекрываю­щиеся гены. Так, у некоторых РНК-содержащих бактериофа­гов Е. coli (R17 и др.) считались установленными три гена — репликазы, белка оболочки и созревания вирусной частицы. Од­нако был обнаружен четвертый ген, кодирующий белок L, вклю­чающий 75 аминокислотных остатков и блокирующий лизис за­раженной клетки. Места для этого гена на РНК не было. Слева у гена обнаружили кодон-инициатор (АУГ), а справа — термина­тор (УАА). Между ними расположено 75 триплетов. Оказалось, что ген локализован частично в гене белка оболочки (47 нуклео­тидов), 36 нуклеотидов — в межгенном интервале и 142 нуклео-тида расположены в гене РНК — репликазы. Перекрывающиеся гены обнаружены также в некоторых одноцепочных ДНК фагов Е. coli и в ДНК вируса млекопитающих SV 40. Таким образом, используются одни и те же последовательности нуклеотидов для кодирования разных белков.

В конце 40-х годов XX в. Б. Мак-Клинток на основе генети­ческих экспериментов на кукурузе предсказала наличие в геноме организмов подвижных элементов — «прыгающих» генов. В конце 60-х годов у бактерий обнаружено два основных класса мобильных («прыгающих») генов, которые различались по длине и сложности организации: 1-й — инсерционные после­довательности, или lS-элементы. Длина их около 1000 пар нук­леотидов. Они содержат только один ген, ответственный за их перемещение; 2-й — транспозоны с длиной 3000—20 000 пар нук­леотидов. Транспозоны кроме системы транспозиции содержат дополнительные гены, определяющие устойчивость к антибиоти­кам, различным токсическим соединениям. В 70-х годах изучены мобильные гены у дрозофилы, затем было выявлено, что у эу­кариот они составляют не менее 5—10 % их генетического мате­риала. Мобильные гены вносят в геном факторы нестабильности и изменчивости, что может играть, по-видимому, существенную роль в эволюции.

ВЛИЯНИЕ ГЕНОВ НА РАЗВИТИЕ ПРИЗНАКОВ

Проявление действия генов на биохимическом уровне начали изучать в 1935 г. Билл и Эфрусси с исследований двух рецессив­ных мутаций окраски глаз у дрозофилы по генам vermilion (яркие глаза) и cinnabar (киноварные глаза). У особей, гомози­готных по этим генам, не образуется пигмент, определяющий нормальную окраску глаз. В результате глаза отличаются от осо­бей дикого типа. Сложные глаза дрозофилы развиваются из за­чатка или диска, образование которого происходит на стадии личинки. Глазной имагинальный диск можно пересадить в по­лость тела другой личинки, где он продолжит свое развитие. Билл и Эфрусси произвели имплантацию эмбриональной ткани

181

дисков глаз из личинок мух с мутантными генами vermilion и cinnabar в личинки нормальных мух-дрозофил и установили, что после метаморфозы этих личинок в зрелых мух имплантирован­ная ткань глаза развилась в дополнительные глаза нормальной окраски. Отсюда был сделан вывод, что в тканях мутантных мух не хватало какого-то вещества для синтеза нормальной окраски глаз.

На основании опытов Билл и Эфрусси пришли к выводу, что образование пигмента идет по пути: предшественник — вещество I— вещество II—пигмент. У мутанта по гену vermilion блокиро­вана реакция, в результате которой предшественник преобразует­ся в вещество I, а у мух с мутацией cinnabar блокирована реак­ция, в результате которой вещество I преобразуется в вещество И. В последующие годы было установлено, что вещество I (V⁺) является кинуренином и мутация V блокирует его образование из триптофана. Вещество II (Сп⁺) оказалось хромогеном — про­дуктом *февращения кинуренина. Мутация Сп блокировала ста­дию образования кинуренина хромогена — предшественника пигмента дикого типа. Исследования показали, что мутации в' генах, кодирующих определенные ферменты, ведут к блокирова­нию биохимических реакций, нарушая превращение определен­ных веществ, что влияет на образование признака — окраски глаз.

В 1940 г. Бидл и Татум избрали для своих исследований новый объект — гриб хлебной плесени нейроспору. У нейроспо-ры в результате последовательной цепи реакций из фенилалани-на синтезируется никотиновая кислота. Было обнаружено шесть мутаций, нарушающих нормальный ход ее синтеза. При помощи культивирования на минимальной среде и добавлении веществ, синтез которых был прерван мутацией, были установлены про­межуточные продукты и порядок их образования при синтезе никотиновой кислоты:

фенилаланин 1+ антраниловая кислота 2+ индол (+ серин) i>

триптофан 1+ кинуренин Д. оксиантраниловая кислота \ никоти­новая кислота.

Генетическое блокирование может происходить на любом из шести этапов, для каждого из которых нужен определенный фермент. Если у штамма нейроспоры произошла мутация на второй стадии, то процесс синтеза заканчивался на образовании антраниловой кислоты и шел дальше, если в среду вводили индол, синтез которого был прерван мутацией. Если мутация произошла на пятой стадии, то синтез обрывался на образовании кинуренина и продолжался только при добавлении в среду окси-антраниловой кислоты.

На основании полученных фактов Бидл и Татум предложили теорию: один ген — один фермент — один признак. По этой теории

182

каждый ген имеет только одну первичную функцию — опреде­лять синтез только одного фермента. Изменение в структуре гена, кодирующего определенный фермент, ведет к его выключе­нию. Если этот фермент не участвует в последовательной цепи реакции, то синтез определенного вещества в организме приос­танавливается на стадии, для которой этот фермент был необхо­дим. При этом возникает новый признак.

Впервые связь между генами и ферментами у человека обна­ружил Гаррод в 1902 г. При анализе родословных больных аль-каптонурией он пришел к заключению, что эта болезнь связана с обменом веществ и передается по наследству. Однако открытие Гаррода было оценено только через много лет, когда было уста­новлено, что целый ряд болезней у человека обусловлен наслед­ственными пороками метаболизма. При изучении фенилаланин-тирозинового обмена у человека было выявлено несколько забо­леваний, связанных с нарушением превращения фенилаланина до конечных веществ биосинтеза (рис. 38). Нарушения связаны с мутацией генов, кодирующих ферменты, принимающие участие на разных этапах метаболизма. Фенилкетонурия возникает в том случае, когда блокируется превращение фенилаланина в тирозин. Это ведет к увеличению фенилаланина в плазме крови, спинно­мозговой жидкости и в моче. Исследования показали, что у