2.2.7 Определение сорбции тяжелых металлов микроорганизмами

Определение проводили следующим образом:

1) в мерную колбу на 50 мл добавляли 1 мл микробной суспензии (или суспензии протопластов);

2) приливали к содержимому мерной колбы 10 мл раствора CuCl₂ концентрацией 0,1М;

3) через 5, 10, 15, 20 и 25 минут центрифугировали культуру микроорганизмов (или взвесь протопластов) и оттитровывали супернатант комплексонометрически по методике, описанной в пункте 2.2.6, определяя количество сорбированного металла за данный промежуток времени;

Для оценки скорости сорбции необходимо построить график зависимости концентрации сорбированной соли от времени сорбции. Далее по результатам построения с помощью программного приложения Microsoft Excel находят линейные уравнения, описывающие каждую из полученных кривых сорбции. Согласно математическим принципам обработки данных, коэффициент при аргументе x равен:

т.е. коэффициент k равен скорости сорбции тяжелого металла тем или иным сорбентом.

Эффективность сорбции определяется следующим образом:

1) разность между начальной и конечной концентрациями соли пересчитывают на массу соли, которую сорбировали микроорганизмы;

2) рассчитывают, используя найденную массу сорбированной соли и графики градуировочной зависимости, абсолютную эффективность сорбента:

(7)

2.3 Результаты и их обсуждение

2.3.1 Получение устойчивых и адаптированных форм микроорганизмов к тяжелым металлам

В качестве чистых культур использовались популяция E. coliи Bacillus subtilis, взятые из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии.

Адаптацию микроорганизмов к тяжелым металлам проводили следующим образом:

1. микроорганизмы были засеяны бактериологической петлей в конденсационную воду скошенной агаризованной питательной среды в пробирках;

2. посевы инкубировались при 37ºС в течение 3 суток, после чего выросшие микроорганизмы переносилась в другую пробирку при помощи смыва физиологическим раствором;

3. далее полученный раствор разбавляли в соотношении 1 мл микробной суспензии к 9 мл физраствора и к полученному раствору приливали 1 мл раствора соли CuCl₂концентрацией 0,001М;

4. пробирку выдерживали в термостатепри температуре 30°С в течение 1 суток, после чего производили засевание микроорганизмов на агар в чашку Петри. Посев инкубировали при 37°С в течение 1 суток;

5. далее осуществляли те же операции, увеличивая при этом концентрацию добавляемой соли до 0,01М и 0,1М.

2.3.2 Получение протопластов Гр(+) и Гр(-) микроорганизмов и изучение их свойств

Культуры исследуемых микроорганизмов - E. coli (Гр(-))и Bacillus subtilis (Гр(+)) - разводят питательным бульоном в соотношении 5 мл микробной суспензии, полученной при смыве со скошенного агара, к 15 мл и выращивают при 30°С в течение 150 минут. Полученный после выращивания микроорганизмов раствор подвергали измерению оптической плотности для определения концентрации содержащихся клеток по построенным ранее градуировочным кривым. В результате выяснили, что концентрация клеток составила 2,4∙10⁶ кл/см³.

Выращенные клетки осаждают центрифугированием при частоте 5000 мин^-1 в течение 10 минут. Супернатант сливают, а в центрифужные пробирки добавляют 2 мл жидкой гипертонической среды ММ9 для получения протопластов, которая содержит лизоцим в концентрации 1000мкг/мл. Бактериальные суспензии тщательно ресуспензируют и инкубируют при 30°С в течение 20-30 минут.

Далее полученные растворы исследуют в течение 30 минут на фотоэлектроколориметре при длине волны 600 нмс периодичностью 5 минут, для того чтобы проследить динамику процесса образования протопластов. Результаты отображены в таблице 3.

Таблица 3 – Результаты измерения оптической плотности

Время, мин	Оптическая плотность суспензии Bacillus subtilis	Оптическая плотность суспензии E. coli
0	0,090	0,064
5	0,130	0,107
10	0,168	0,149
15	0,193	0,179
20	0,204	0,189
25	0,212	0,192
30	0,215	0,194

По полученным в ходе эксперимента данным были построены зависимости, отображающие изменение оптической плотности каждого из растворов с течением времени. Они изображены на рисунках 6 и 7.

Рисунок 8 – Зависимость оптической плотности от времени протопластирования для культуры Bacillus subtilis

Рисунок 9 – Зависимость оптической плотности от времени протопластирования для культуры E. coli

Для оценки эффективности протопластирования был рассчитан выход протопластов. Для этого полученный при центрифугировании супернатант подвергли измерению оптической плотности для выявления концентрации оставшихся после центрифугирования клеток (это и есть клетки, не подвергшиеся воздействию лизоцима согласно формуле 3). Было выяснено, что концентрация оставшихся клеток составила 5,1∙10⁵ кл/см³. Тогда, воспользовавшись формулой 3, получили, что выход протопластов микроорганизмов составил: