Гистологические методы исследования.

Существует два основных пути микроскопического исследования клеток и тканей в зависимости от их состояния.

1. Исследование неживых (фиксированных) клеток и тканей, сохраняющих в известной степени прижизненные морфологические особенности.

2. Исследование живых и переживающих клеток и тканей (витальное и суправитальное).

Исследование фиксированных клеток и тканей требует приготовления гистологического препарата, который представляет собой специальным образом обработанный тонкий срез, отпечаток или мазок ткани или органа. Комплекс методических приемов, использующихся при изготовлении гистологического препарата, называется гистологической техникой. Таким образом, термин «гистологическая техника» по своему содержанию является более узким по сравнению с понятием «гистологические методы исследования» и означает лишь один из многочисленных методов исследования, используемых в гистологии.

Классическим и основным объектом исследования в гистологии продолжает оставаться срез органа и ткани, из которого готовится гистологический препарат. Гистологические препараты, изучаемые с помощью светового микроскопа, должны иметь незначительную толщину, прозрачность и светооптическую активность, что достигается в процессе его изготовления.

Изготовление гистологических препаратов клеток и тканей (гистологическая техника) для последующего микроскопирования включает следующие этапы:

1. Взятие материала

2. Фиксация

3. Промывание

4. Обезвоживание

5. Уплотнение кусочка

6. Изготовление срезов

7. Окрашивание срезов

8. Обезвоживание срезов

9. Просветление срезов

10. Заключение срезов.

Последовательность и правильное выполнение этих операций относительно сохраняет прижизненную структуру органа, а гистологические красители, подбираемые в зависимости от целей исследования, окрашивают бесцветные тканевые элементы и части клеток в различные цвета, делая их четкими, контрастными, т.е. оптически активными.

Взятие материала

При взятии материала следует соблюдать следующие правила:

1. Объекты, подлежащие исследованию, должны быть свежими. Этому условию больше всего удовлетворяет материал, взятый прижизненно или у только что забитого животного (мазок крови здорового или больного человека, пунктат костного мозга, селезенки и др. органов и т.д.). В клинической практике часто прибегают к морфологическому изучению органов путем взятия (биопсии) кусочков больного органа во время операции. При исследовании кусочков, взятых от трупов, приходиться сталкиваться с теми или иными посмертными изменениями. Там не менее из трупного материала можно приготовить хорошие обзорные препараты, применив ряд специальных методик.

2. При взятии кусочков для предупреждения повреждения материала необходимо манипулировать острыми инструментами (острый скальпель, лезвие)

3. Иссекая кусочки, необходимо учитывать микроскопическое строение того или иного органа. Например, кусочки почки или надпочечника, гистологическое строение которых неодинаково на поверхности и в глубине, вырезают с таким расчетом, чтобы в них попали все слои органа. Из органов, имеющих во всех частях одинаковое строение (печень, селезенка и т.д.) кусочки иссекают без строгого учета глубины, но как правило, вместе с капсулой.

4. Иссекаемые кусочки органов по размерам должны быть не более 1см³.

Фиксация имеет цель максимально сохранить прижизненную структуру тканей путем быстрого воздействия на них химическими или физическими агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений. Фиксация вызывает иногда некоторые изменения в структуре ткани (гистологические артефакты) , однако удачный выбор фиксатора обеспечивает наименьшие нарушения структуры.

Принципы фиксации: а) осаждение биологических макромолекул,

б) блокада химических группировок последних.

Способы фиксации: а) физические (высушивание, замораживание),

б) химические (действие кислот, солей тяжелых металлов).

Чаще всего используются химические способы фиксации. При этом кусочки органов или тканей обрабатываются особыми жидкостями – фиксаторами.

При фиксации необходимо, чтобы фиксируемый материал равномерно омывался фиксирующей жидкостью: объем последней должен превышать объем фиксируемого препарата не менее чем в 10 раз. Фиксирующие жидкости должны обладать способностью быстро проникать в глубь кусочков, в обратном случае в кусочках могут развиваться деструктивные изменения, обусловленные аутолитическим действием ферментов, аноксией и др.

В зависимости от того, является ли действующим началом одно вещество или несколько веществ, фиксаторы бывают простые и сложные.

Простые фиксаторы (этиловый спирт, метиловый спирт, растворы формалина, насыщенный водный раствор сулемы, 2% четырехокись осмия, 2,5% глютаровый альдегид и др.)

Этиловый спирт по своим свойствам является почти «идеальным» фиксатором: фиксирует материал с минимальными изменениями его химического состава. В связи с этим, спиртовая фиксация применяется в гистохимических исследования ибо дает возможность сохранить в тканях гликоген, мукоидные вещества, железосодержащие пигменты, мочевую кислоту и др. Преимуществом спиртовой фиксации является и то что она не требует последующей промывки и обезвоживания материала и его уплотнения. Недостатком фиксации в спирту является сильное обезвоживание тканей, что вызывает их уплотнение и сжатие. Кроме того при спиртовой фиксации извлекаются и растворяются из ткани жиры и жироподобные вещества.

Формалин представляет собой насыщенный водный раствор формальдегида. Как фиксатор, формалин употребляется в 10,15 и 20% концентрации. Формалиновая фиксация имеет ряд преимуществ: формалин обладает значительной проницаемостью и хорошо фиксирует за 24-48 часов даже относительно большие кусочки; кусочки органов могут длительное время (годами) храниться в 10-15% растворах формалина, не теряя способности окрашиваться при дальнейшей обработке; после формалиновой фиксации можно применять разнообразные методы обработки и окраски материала.

Сложные фиксаторы (жидкость Мюллера, жидкость Буэна, жидкость Ценкера и др.). В своем составе они содержат несколько компонентов.

Например, Жидкость Каркуа включает : 60мл 100⁰ спирта, 30мл хлорамина, 10 мл уксусной кислоты.

Жидкость Мюллера содержит: 2,5 г двухромкислого калия, 1,0 г сернистого натрия, 100 г дистиллированной воды.

Выбор фиксатора зависит от цели исследования. Так, для изучения содержания гликогена в тканях наилучшим фиксатором является этиловый спирт; для сохранения же в клетках жира необходимо формалиновая фиксация, а не спиртовая, т.к. спирт растворяет жиры. При выборе фиксирующей жидкости необходимо учитывать неодинаковую проницаемость тканей для разного вида фиксаторов. В случае медленного проникания фиксатора в тканях могут развиваться деструктивные изменения, связанные с аутолитическим действием ферментов, аноксией и т.д. В связи с этим, при фиксации слабо проникающими фиксаторами, например, четырехокисью осмия, кусочки органов берутся толщиной не более 0,5-1,0 мм. В других случаях к таким фиксаторам добавляют химические вещества, повышающие проницаемость; например, с этой целью в состав фиксатора Ценкера вводят уксусную кислоту. Для исследования содержания в тканях растворимых соединений используют методы замораживания-высушивания (лиофилизация). Лиофилизация включает быстрое замораживание тканей с помощью жидкого азота и обезвоживание её (сушку) в вакууме при температуре 30-40⁰ с последующим уплотнением парафином.

Промывание кусочков обеспечивает удаление остатков фиксатора. После формалиновой фиксации промывают кусочки под проточной водой в течении 25-48 часов. После фиксации в смесях, содержащих пикриновую кислоту, сулему, кусочки промывают в спиртах повышающейся крепости.

Обезвоживание. Кусочек органа нельзя переносить из воды сразу в крепкий спирт: вследствие быстрой отдачи воды может произойти сжатие кусочков и нарушение прижизненной структуры тканей. Благодаря постепенному отнятию воды, кусочки становятся боле плотными. Обезвоживание обеспечивается проведением кусочков через набор спиртов возрастающей крепости: 50%, 70%, 80%, 90% и 100%; в каждом из них кусочки выдерживают 12 и более часов. После обезвоживания в большинстве случаев кусочки остаются недостаточно плотными, а, главное, недостаточно однородными.

Поэтому вслед за обезвоживанием кусочки уплотняют и заливают в специальные плотные среды для получения из них тонких срезов.

Уплотнение и заливка в застывающие среды. Самым распространенным и удобным способом для любых тонких гистологических исследований является уплотнение и заливка в парафин или целлоидин. Принцип уплотнения и заливки заключается в последовательном проведении кусочков через ряд жидкостей, из которых каждая предыдущая обладает способностью смешиваться с последующей.

Схема уплотнения и заливки кусочков в парафин.

1. 100% спирт – 2часа.

2. Смесь 100⁰ спирта и ксилола 1:1 – 1-3 часа.

3. Чистый ксилол – 3 часа.

4. Вторая порция чистого ксилола (в другой емкости) – 3 часа.

5. Насыщенный раствор парафина в ксилоле – 6 часов.

6. Чистый парафин, расплавленный при температуре 56⁰ – 2-4 часа.

7. Заливка уплотненных кусочков парафином в бумажных или металлических формочках.

8. Охлаждение в воде.

9. Выделение кусочка с окружающим парафином и наклеивание на деревянные бруски (получение блоков).

При заливки кусочков в парафин возникает необходимость выдерживания их при температуре 56⁰, что может отразиться на структуре исследуемого органа. Преимуществом парафинового уплотнения является возможность приготовления очень тонких срезов и значительная экономия времени, которое тратится на уплотнение.

Целлоидин представляет собой нитроклетчатку, способную растворяться в смеси спирта с эфиром.

Схема уплотнения и заливки кусочков в целлоидин.

1. 100% спирт – 2-4 часа

2. Смесь спирта и эфира в равных частях – 24 часа в закрытой посуде.

3. 2,4,8% раствор целлоидина в смеси спирта и эфира – 7-14дней в каждом растворе.

4. Из 8% раствора целлоидина уплотненный кусочек вместе с целлоидином выливается в плоскую чашку, которая помещается в эксикатор с крышкой. Вследствие постепенного испарения спирта и эфира целлоидин застывает в плотный студень, в который оказывается заключенный кусочек.

5. Наклеивают кусочки на деревянные бруски и хранят их в 70⁰ спирте. Целлоидиновые кусочки очень легко режутся, а срезы из них окрашиваются большинством красителей; однако толщина целлоидиновых срезов больше, чем у парафиновых, что является значительным недостатком.

Наиболее удобным способом, обеспечивающим быстрое уплотнение кусочков, является замораживание. Однако при этом очень трудно получить достаточно тонкие срезы. Кроме того, метод замораживания нельзя применять при работе с очень мелкими объектами; срезы тканей и органов, полученные из замороженного кусочка крошатся и при оттаивании распадаются, в связи с этим, многие объекты приходится заливать в парафин или целлоидин.

Можно использовать прием комбинированного уплотнения : заливку пропитанных целлоидином кусочков в парафин, что позволяет соединить преимущества двух методов.

Широкое применение находит для биологических объектов синтетические смолы (аралдит, эпон и др.), особенно при изготовлении препаратов для электронной микроскопии.

Изготовление срезов. Производится с помощью микротома.

Микротом-аппарат, предназначенный для производства тонких срезов, приготовленных для микроскопического исследования; состоит из основания, приводного механизма, механизма микроподачи, объектодержателя, ножодержателя. Получение среза осуществляется движении ножа или объекта в одном направлении. При обратном движении срабатывает механизм подъема объекта на заданную величину, что обеспечивает необходимую толщину среза.

Микротомы бывают двух типов:

1. санные и радиальные микротомы, в которых объект укреплен неподвижно в держателе, а нож производящий срезы, неподвижен.

2. ротационные микротомы, в которых объект при помощи специального механизма движется по вертикали или горизонтали и надвигается на лезвие неподвижного ножа, с каждым срезом смещаясь на заданную величину.

Санные, радиальные микротомы используют для получения срезов из кусочков, уплотненных целлоидином или парафином. Для получения срезов, уплотненных замораживанием, используют замораживающий микротом, в котором кусочек уплотняется в условиях пониженной температуры жидкой углекислотой, подводимой от баллона к столику микротома. Для сохранения среза в замороженном состоянии после снятия его с ножа используют микрокриостат, который представляет собой небольшую холодильную камеру, прикрепленную к замораживающему микротому. При помощи жидкой углекислоты можно регулировать температуру в этой камере от 0 до -70⁰С. К приспособлениям, обеспечивающим качественное приготовление срезов на замораживающем микротоме, относятся криостаты с регулируемым охлаждением микротомного ножа.

Для получения срезов из замороженных биопсийных кусочков, а также при гистохимических исследованиях (изучение ферментного, антигенного и др. состава тканей) используют микротом-криостат, представляющий собой термоизоляционную камеру с микротомом и системой охлаждения.

Для приготовления сверхтонких срезов, необходимых для электронно-микроскопических исследований, применяют ультрамикротом, где выполнение всех операций приготовления препарата и внесения его в поле зрения микроскопа полностью автоматизировано; резание в ультрамикротоме осуществляется посредством перемещения стержня с исследуемым объектом относительно неподвижного ножа. Для равномерной подачи объекта к ножу используют либо термическое, либо механическое расширение стержня, на котором закреплен объект. Изменяя число срезов в минуту и скорость подачи объекта к ножу, можно получить срезы любой толщины.

Для автоматизации гистологической обработки тканей разработаны полуавтоматы «Аутотехникон», «Гистохромагор», имеющие программное устройство и обеспечивающие автоматизацию фиксации, промывки, уплотнения и заливки, производства срезов с последующей их окраской.

Окрашивание срезов.

Целью окраски является обеспечение светооптической активности структур в срезах ткани и органов путем обработки их различными красителями.

Гистологические красители.

1. кислотные, представляющие собой красящую кислоту или ее соль (эозин, пикриновая кислота, кислотный фуксин, оранж),

2. основные,представляющие собой красящее основание и его соли (фуксин, метиленовый синий, гематоксилин, азур),

3. нейтральные, представляющие собой соль красящего основания и красящей кислоты (эозиново-кислый, метиленовый синий, азур-эозин, гематоксилин-эозин).

Структуры, избирательно окрашивающиеся основными красителями, называются базофильными (базофильные ядра, цитоплазма белок- синтезирующих клеток). Структуры, окрашивающиеся кислотными красителями, называются оксифильными (цитоплазма большинства клеток, коллагеновые волокна соединительной ткани).

Существуют следующие окраски, основанные на различных принципах:

1. Избирательная окраска ядра и цитоплазмы, основанная на разнице pH ядра (кислая реакция) и цитоплазмы (щелочная или нейтральная реакция).

2. Осаждение металлов из солевых растворов, при этом металлический осадок откладывается прежде всего на плотных структурах клетки (мембраны органоидов) или на волокнах межклеточного вещества. При этом методе окраски, называемым импрегнацией, используются растворы азотнокислого серебра, четырехокиси осмия, хлорного золота. Импрегнация серебром используется для выявления ретикулярных волокон соединительной ткани, некоторых органоидов, нервных клеток и их отростков, включая нервные окончания.

3. Методы, основанные на химическом взаимодействии красящих реактивов с определенным компонентом клетки (гистохимические методы). Продукты взаимодействуя осаждаются в месте локализации этих компонентов. В отличие от общегистологических методов, гистохимические методы выявляют совершенно определенные вещества в клетках (ферменты, дезоксирибонуклеиновую и рибонуклеиновую кислоты, гликоген).

4. Прижизненное окрашивание впервые предложено Н.А.Хрыщевским, А.Д.Ковальским, Р.Г. Гейденгайном. основано на введении красителя (тушь, трипановый синий, нейтральный краситель) в кровь или под кожу животного с последующим приготовлением препаратов из тканей, клетки которых захватили (фагоцитировали) краситель. Подавляющее большинство неповрежденных клеток животного организма обладают способностью конденсировать в цитоплазме краситель в виде гранул, а сама цитоплазма и ядро клетки при этом, как правило, не окрашиваются.

Академиком Д.Н.Насоновым и его сотрудниками метод прижизненной окраски использовался при цитофизиологических исследованиях для обоснования учения о паранекрозе. Паранекроз – сложный комплекс изменений цитоплазмы клеток, возникающий под влиянием различных повреждающих воздействий. Одним из доступных для изучения признаков паранекроза является изменение характера прижизненной окраски цитоплазмы. Паранекротические изменения проявляются в подавлении способности клетки к гранулообразованию, вследствие чего красители распределяются в цитоплазме диффузно.

Таким образом, с помощью прижизненной окраски можно судить о функциональном состоянии клеток. Именно этот метод помог в свое время Гольдману (1912) выявить в организме животных общую в функциональном отношении группу клеток, способных поглощать введенный в организм трепановый синий, т.е. клетки макрофагической системы. В эмбриологии прижизненные красители (нейтральный красный, сульфат нильского синего и др.) применяются для маркировки развивающегося зародыша. Цветные метки помогают прослеживать перемещение клеточного материала зародыша в процессе эмбриогенеза. Отечественный ученый А.М.Шумлянский (1782),инъецируя краски, изучал структуру кровеносных сосудов и мочевых канальцев почек. Прижизненные красители находят применение и в клинической практике. Например, для изучения экскреторной функции желудка используется краситель нейтральный красный. В отечественной нейрогистологии нашла широкое распространение методика прижизненной окраски метиленовым синим тканевых элементов нервной системы, предложенная А.Догелем (1908).

Обезвоживание срезов осуществляется кратковременным помещением их в спирты возрастающей концентрации.

Просветление срезов обеспечивает прозрачность срезов и достигается обработкой смесью ксилола и карболовой кислоты.

Заключение срезов обеспечивает сохранность препарата. На срез наносится канадский бальзам и накладывается покровное стекло.

Полученный препарат готов для изучения в световом микроскопе и может храниться годами.