Исследование живых клеток и тканей.

В качестве объекта исследования в гистологии может быть использо-

вана и культура ткани, предложенная впервые И.И. Скворцовым (1885). Метод культуры тканей позволяет изучать живую клетку (ее развитие, жизнедеятельность, реакции на неблагоприятное воздействие). При этом можно изучать живые клетки или ткани не нарушая связи их с организмом (микроскопия поверхностных кровеносных сосудов ногтевого ложа человека, глазная микроскопия с использованием роговичного микроскопа). Помимо этого, существуют методы изучения живых тканей, извлеченных из организма. В зависимости от того, просто ли поддерживается жизнь тканей или происходит их активный рост, можно говорить о переживающем препарате или собственно культуре тканей (культура in vitro – «в стекле»). Маленький кусочек ткани помещается в физиологический раствор или питательную жидкость (влага передней камеры глаза и др.), покрывается стеклом и исследуется в световом микроскопе. Такой метод прижизненного наблюдения позволяет исследовать и фотографировать поведение живой или переживающей клетки в течении определенного времени.

В области культуры тканей входит и микрургия – совокупность методических приемов, дающих возможность производить с помощью специальных микроманипуляторов разнообразные операции над помещенными в питательную среду клетками (пересадка ядер и ядрышек, введение в изолированные клетки различных веществ и др.)

Для изучении продукции гормонов, кроветворения, злокачественного роста нередко применяют культивирование клеток в диффузионных камерах, стенки которых сделаны из миллипорных фильтров, пропускающих макромолекулы, но не пропускающие клетки. Такие камеры имплантируют в различные ткани организма и наблюдают изменения, происходящие в клетках под влиянием гормонов или других веществ, введенных в камеру одновременно с клетками.

Метод культуры тканей используют в иммуноморфологии для изучения состояния защитных систем организма. Так, клеточный иммунитет различают по следующим тестам:

1.Торможение миграции макрофагов из капилляров, эксплантатов и др. под влиянием лимфоцитов крови.

2.Цитотоксическе действие лимфоцитов крови на клетки – «мишени».

3.Трансформация (превращение) лимфоцитов крови в клетки - бласты под влиянием чужеродного белка (антигены).

Изучение живых клеток возможно и при «перемалывании» их в специальной ступе с целью высвобождения содержимого клеток с последующим центрифугированием при строго определенных скоростях. При этом в зависимости от плотности, разные компоненты клетки будут оседать с различной скоростью. После этого каждая фракция подвергается анализу с целью определения состава и химической активности.

В гистологии широко используются экспериментальные методы исследования. Создавая в эксперименте соответствующие условия, можно изучить реактивность тканей и клеток, их адаптационные и восстановительные способности. «Патология учит нас нормам, может быть, наиболее глубоко; болезнь, нанося удары, как бы раскрывает тайны живого» (Томас Манн).

Таким образом, современная гистология располагает целым комплексом методов исследования, позволяющих изучать морфологию живого организма на разных уровнях его организации. Благодаря применению новейших методов гистологических исследований, обнаружены новые клеточные органеллы, уточнены механизмы взаимоотношения клеток, передачи наследственности, факторы, определяющие различные стороны их жизнедеятельности, знание которых необходимо для решения проблем управления жизненными процессами на всех уровнях их организации. Многие морфологические методы получили признание и применение в клинике (изучение количественного и качественного состава клеток крови, красного костного мозга, пунктатов печени и др.)

Документация, с помощью которой регистрируется (фиксируются) результаты исследования:

1. Постоянные препараты (могут храниться годами в специально созданных картотеках)

2. Кино-фотопленки.

3. Рисунки с гистологических препаратов

4. Словесное описание препарата (протокол)

5. Цифровой фантом в памяти ЭВМ.

Контрольные вопросы к практическому занятию.

1. Задачи и методы современной гистологии.

2. Понятие о гистологическом препарате. Техника приготовления гистологических препаратов.

3. Правила взятия материала для гистологических исследований.

4. Принципы и способы фиксации. Классификация и характеристика фиксаторов.

5. Методы уплотнения и заливки материала.

6. Микротомия (изготовление срезов)

7. Принципы и методы окраски гистологических срезов.

8. Классификация гистологических красок. Понятие о базофилии и оксифилии.

9. Обезвоживание, просветление и заключение срезов.

10. Специальные методы гистологических исследований.

11. Методы количественного анализа в гистологии.

12. Правила работы со световым микроскопом. Специальные виды микроскопии.

13. Принцип работы электронного микроскопа. Техника приготовления препаратов для электронной микроскопии.

Методические указания к практическому занятию.

Цель практического занятия:

1. Освоить общепринятую методику окрашивания парафиновых срезов гематоксилин-эозином.

2. Научиться находить в препарате структуры, отличающиеся своими тинкториальными свойствами.

Схема окраски готовых парафиновых срезов гематоксилин-эозином (основана на разнице pH ядра и цитоплазмы).

1. Депарафинирование среза: ксилол I - 5 минут,

а. ксилол II - 3 минуты.

2. Удаление ксилола: спирт 100⁰, 96⁰, 80⁰, 70⁰, 50⁰ по 2 минуты.

3. Промывание среза водой.

4. Окраска ядер: гематоксилин – 5минут, затем 0,1 солянокислый спирт (для окисления гематоксилина в красящее вещество – гематеин) 3 сек. (до посинения среза).

5. Промывание водой 1-2 минуты. Рассмотрите под микроскопом срезы, окрашенные гематоксилином: в срезах выявлены базофильно окрашенные ядра.

6. Окраска цитоплазмы клеток – эозин раствор – 3 минуты.

7. Промывание водой. Рассмотрите под микроскопом срезы, окрашенные гематоксилин-эозином: наряду с базофильно окрашенными ядрами выявлена оксифильная цитоплазма.

8. Обезвоживание срезов: спирт 50⁰ ,60⁰, 80⁰, 90⁰ по 1 минуте

9. Просветление срезов: карбол – ксилол 3 минуты,

ксилол - 1 минута.

10. Заключение срезов: канадский бальзам, покровное стекло.Полученный препарат готов для использования.

Работая с микроскопом помните:

1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа покровным стеклом вверх.

2. Тубус микроскопа опускают, следя за тем, чтобы не раздавить препарат (глядя сбоку).

3. Микровинтом пользуются только при большом увеличении и вращают его не более чем на ±5 оборота.