Стерилизация питательных сред

Питательные среды стерилизуют главным образом автоклавированием. Этот способ основан на прогревании субстрата насы­щенным паром при давлении выше атмосферного. Когда давление пара повышается, возрастает его температура (таблица).

Таблица. ТЕМПЕРАТУРА НАСЫЩЕННОГО ПАРА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ДАВЛЕНИЯХ

Давление, атм		Темпера­тура, град. С
нормальное	добавочное
1,0	—	100
1,0	0,5	112
1,0	1,0	121
1,0	1,5	128
1,0	2,0	134

Совместное действие высо­кой температуры и пара обеспе­чивает надежность стерилиза­ции: при автоклавировании по­гибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Автоклавирование проводят при различных режимах. Когда указывают режим стерилизации в единицах давления: 0,5; 1,0; 2,0 атм, — имеют в виду допол­нительное давление.

Режимы стерилизации сред. Температура и длительность автоклавирования определяются прежде всего составом питательной среды. Субстраты, содержащие вещества, не выдерживающие на­гревания до 120°, стерилизуют при 0,5 атм. Молоко, дрожжевой автолизат, дрожжевую воду и среды с желатиной стерилизуют при 0,5 атм в течение 15 мин. Среды, содержащие сахара и витамины, например сусло пивное, соки, стерилизуют при 0,5 атм 20—30 мин. Мясопептонный бульон и мясопептонный агар автоклавируют при 1 атм 20—30 мин, картофельную среду и почвенную вытяж­ку, при 1,5 атм 30 мин.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать рН сре­ды. В случае кислой реакции среды при автоклавировании могут подвергнуться гидролизу входящие в ее состав полимеры. Так, если рН среды ниже 6,5—6,0, то происходит пептонизация желатины, и среда после стерилизации не застывает. При рН ниже 5,0 частично гидролизуется и теряет способность образовывать гель агар-агар.

Если среда щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа, карамелизуются и становятся недоступными для мик­роорганизмов сахара. Чтобы избежать этих явлений, среды, пред­назначенные для культивирования кислотолюбивых или щелочелюбивых микроорганизмов, стерилизуют при нейтральном значении рН и только после автоклавирования подкисляют или подщелачивают. Кроме того, растворы ряда компонентов часто стерилизуют отдельно при таком рН и в том режиме, при которых они не изменяются, a затем стерильно добавляют в среды в нуж­ном количестве.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ СТЕКЛЯННОЙ ПОСУДЫ СУХИМ ЖАРОМ.

Материалы и оборудование: чашки Петри, воздушный стерилизатор, бумага. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду в сушильном шкафу. Чашки Петри перед стерилизацией должны быть вымыты и высушены.

Ход работы: Чтобы избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, перед стерилизацией чашки Петри заво­рачивают в оберточную бумагу. Бумага нарезается в виде квад­рата, сторона которого приблизительно равна диаметру чашки. Чашку Петри помешают на средину листа, загибают его с двух противоположных сторон кверху так, чтобы края налегали друг на друга. Два свободных конца подгибают вниз. При таком обер­тывании у чашек легко различить верх и низ.

Подготовленные таким образом чашки Петри помещают в су­шильный шкаф, в котором нагревают их при температуре 160-170 °С в течение двух часов (с момента установления нужной температуры). При таком прогревании погибают не только ве­гетативные клетки, но и споры. Температуру в сушильном шкафу выше 175 ° С допускать не следует, так как при этом бумажная обертка становится ломкой.

Чашки Петри завертывают каждую отдельно, на можно завертывать вместе по 2—3 чашки. В концы пипеток вставляют ватные тампоны. Пипетки заворачивают в длинные по­лоски бумаги шириной 4—5 см. Обмотку начинают с конца, следя за тем, чтобы конец пипетки был тщательно завернут бумагой. Постепенным движением полоски бумаги по спирали оканчивают обмотку у про­тивоположного конца — того, который берется в рот. Завернутые пипетки перед стерилизацией по нескольку штук вместе заворачивают в бумагу или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Шпатели также заворачивают отдельно в бумагу. Колбы, пробирки закрывают ватными пробками, на колбу надевают бумажные колпачки, предохраняю­щие горлышко от пыли. Посуду, подготовленную для стерилизации, загру­жают в сушильный шкаф или в автоклав не слишком плотно, чтобы не затруднять циркуляции воздуха и обес­печить равномерный прогрев стерилизующегося мате­риала. Нельзя обертывать пробки сосудов целлофаном или другими материалами, не пропускающими пар. Пар дол­жен свободно проникать через пробку в сосуд, в про­тивном случае среды не прогреваются до нужной темпе­ратуры и стерилизации не происходит.

Обработка лабораторной посуды

• Новую лабораторную посуду 15 мин. кипятят в мыльной воде, затем ополаскивают чистой водой, погружают в теплый 1-2% р-р соляной кислоты и, доведя до кипения, вываривают 10-15 мин. После этого посуду тщательно промывают водопроводной водой и дважды – дистиллированной.

• При мытье посуды, используемой для серологических реакций, кислоты и щелочи не применяют, ее моют горячей водой, кладут на сетки (чтобы стекла вода), затем несколько раз ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу.

• Посуду, предназначенную для приготовления и хранения питательных сред и культивирования микробов, нельзя обрабатывать дезинфицирующими веществами. Их присутствие, даже в незначительном количестве, делает питат. среду непригодной для размножения микроорганизмов.

• Пипетки и другая градуированная посуда должна хорошо обезжириваться, иначе на ее стенках при вливании жидкости остается большое количество капель, вследствии чего слитый объем жидкости не будет соответствовать величине, указанной на шкале деления.

Завертка пипеток (а) и чашек Петри (б)

• Предметные и покровные стекла должны быть абсолютно чистыми и хорошо обезжиренными. Новые предметные стекла промывают в воде и хранят в 96⁰ спирте или смеси Никифорова. Стекла, бывшие в употреблении, кипятят в течение часа в 5-10% р-ре соды или мыльной воде, тщательно промывают водопроводной водой и вытирают досуха. При достаточном обезжиривании стекла нанесенная на ее поверхность капля воды расплывается равномерно. Недостаточно обезжиренные стекла обрабатывают повторно: с обеих сторон натирают мылом, затем тщательно протирают влажной тряпкой и ополаскивают в спирте. Хранят их в банке (пустой, в спирте или спирт-эфире поровну). Чистые стекла берут пинцетом. Нельзя прикасаться пальцами к поверхности стекла, т. к. на нем остаются отпечатки кожи рук. Покровные стекла кипятят в щелочной воде (с содой или мылом), обрабатывают спиртом, вытирают досуха и хранят в коробке или небольшом боксе.

• При обработке пипеток для втягивания в них моющего средства пользуются надетым на нее резиновым баллончиком.

• Посуда, в которой содержался исследуемый материал, обезвреживается кипячением или стерилизацией в автоклаве, а затем моется с помощью ерша, щетки или мелко нарезанных кусочков бумаги, соломы. Нельзя употреблять при мытье посуды песок и другие вещества, царапающие стекло. Градуированные пипетки тщательно протирают внутри тампоном ваты или марли, накрученной на тонкую упругую проволоку.

• Если обычному мытью посуда поддается с трудом, ее заливают на 30-40 минут хромовой смесью, после чего промывают водопроводной, затем дистиллированной водой. Вымытую посуду не вытирают, а сушат при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре 100-105⁰ С, а для обеззараживания стерилизуют.

Дезинфекция - это мероприятия, направленные, на унич­тожение или резкое подавление численности патогенных и ус­ловно-патогенных микроорганизмов во внешней среде, в том чис­ле на объектах и изделиях. Целью дезинфекции является предуп­реждение или прерывание передачи возбудителей от инфицированного индивидуума к интактному через объекты внешней среды (факторы передачи).

Используют следующие методы дезинфекции:

• химический,

• физический (кипячение, сжигание, ультрафиолетовое облуче­ние),

• механический (встряхивание, обработка пылесосом, влажная уборка, проветривание, стирка, мытье),

• биологический.

Практически чаще всего используют комбинацию нескольких методов в различных сочетаниях с учетом конструкции объекта, пред­полагаемой массивности микробной контаминации, свойств дезинфектанта и т.п.

В медицинских учреждениях преимущественно применяют для дезинфекции достаточно высокие концентрации химических веществ, обладающих широким спектром микробоцидного действия (дезинфектанты), реже используют сочетание дезинфектанта с температурной обработкой (пароформалиновая дезинфекция) или вместе с поверх­ностно-активными веществами.

В очагах туберкулеза, сибирской язвы, кишечных инфекций де­зинфекция проводится с учетом свойств конкретных возбудителей со­ответствующих заболеваний. В больничных учреждениях обычно уничтожают широкий спектр патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Применяют следующие основные группы дезинфектантов:

• галоидсодержащие, в них активно действующим антимикроб­ным началом являются хлор, бром или йод (хлорная известь, соли гипохлорита кальция, хлорамины, дихлорциануровая кислота и ее соли, аквасепт, йодонат, дибромантин);

• кислородсодержащие на основе перекисных содинений или перекиси водорода (первомур, ПВК, перамин, виркон, дезоксон);

• поверхностно-активные вещества на основе четвертично-аммониевых соединений и амфотерных поверхностно-активных соеди­нений (аламинол, дюльбаль, санифект, велтолен, гермосепт, септодор);

• гуанидины и их смеси с ПАВ (демос, катасепт, лизоформин, пливасепт);

• спирты (на основе этанола);

• альдегидосодержащие на основе глутарового или янтарного альдегидов (гигасепт, сайдекс, глутарал, альдесол);

Фенол как дезинфектант запрещен из-за высокой токсичности и стойкого раздражающего запаха. Сейчас из фенолсодержащих препаратов рекоменду­ют новые его разновидности, лишенные указанных отрицательных свойств (амоцид и др.).

Если дезинфекции подвергали изделие медицинского назначе­ния — эндоскопы, катетеры и тому подобные объекты, то после окончания дезинфекции они обязательно должны быть промыты водой от дезинфектанта.

Антисептика — это система мер быстрого подавления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на коже и сли­зистых хирургов, оперируемых, раненых, персонала особо чистых производств. В принципе антисептика — это щадящая дезинфекция применительно к человеку.

Главным методом антисептики является обработка химическими веществами с преимущественно микробостатическим действием (ан­тисептиками) с учетом спектра их антимикробной активности и чув­ствительности конкретных возбудителей.

Деконтаминация с помощью антисептиков предполагает подав­ление патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при ус­ловии сохранения непатогенных видов. Исключение составляет антисептическая обработка рук оператора и операционного поля па­циента, а также ран и слизистых оболочек иммунодефицитных лиц, когда необходимо более полное освобождение названных биотопов от всех микроорганизмов.

Для антисептики применяют растворы кислородсодержащих пре­паратов на основе перекисных соединений или перекиси водорода (первомур и др.), спирты и другие вещества с дезинфицирующими свойствами. Конечно, концентрация антисептических растворов су­щественно ниже, чем при использовании в качестве дезинфектантов.

Асептика включает в себя совокупность прямых (стери­лизация, дезинфекция, антисептика) и косвенных методов воз­действия на микроорганизмы с целью создания безмикробной зоны или зоны с резко сниженной численностью микроорганизмов для проведения медицинских вмешательств и исследовательских мани­пуляций.

Асептическая практика применяется в операционных, родильных залах, лабораторных и инфекционных боксах, в абактериальных па­латах для лиц с трансплантированными органами, в кювезах для недоношенных детей, в биотехнологии и производстве многих лекар­ственных препаратов. О прямых методах воздействия на микроорга­низмы уже сказано выше. Косвенные, т.е. разделительные меры, зак­лючаются в использовании герметичных перегородок в рабочих по­мещениях, специальной одежды и обуви, перчаток, системы воздушных бактериальных фильтров.

Таким образом, предупреждают или снижают риск заноса микро­организмов в «рабочую зону», которой может быть операционная рана, питательная среда, пищевой продукт, инъекционный раствор, орга­низм ослабленного больного.

Задание

1. Ознакомиться с методами стерилизации и соответствующей аппаратурой

2. Подготовить стерильную посуду: пробирки, бактериологические чашки, градуировочные пипетки, мензурки, микропипетки, колбы Эрленмейера. Каждый студент завертывает в бумагу 5 чашек Петри, 5 градуированных пипеток, 5 пробирок и помещает их в печь Пастера для стери­лизации. Во избежание склеивания чашек при стери­лизации сухим жаром необходимо между ними проло­жить листочки бумаги.

3. В рабочей тетради по лабораторным занятиям письменно оформляется отчет по данному занятию в следующей последовательности: номер работы, тема, цель занятия, письменный ответ на поставленные контрольные вопросы.

Вопросы для самоконтроля:

1. Какие физические и химические факторы наиболее сильно подавляют микроорганизмы?

2. Какие цели ставятся при проведении стерилизации, дезинфекции, антисептики, асептики.

3. Назовите основные способы стерилизации.

4. Перечислите основные методы дезинфекции.

5. Чем отличается антисептика от дезинфекции?

Лабораторное занятие №7

КУЛЬТУРАЛЬНЫЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ – продолжение – Выделение чистой культуры аэробных бактерий

Цель:

1. Освоение методов посева инокулята

2. Проведение II этапа выделения и идентификации чистой культуры аэробных бактерий

3. Уяснение основных этапов идентификации бактерий