Иммунологические тесты, которые характеризуют гуморальный иммунитет (в – звено).

Гуморальное звено иммунной системы оценивают по таким показателям:

• Количество В-лимфоцитов;

• Количество сывороточных иммуноглобулинов (классов A, M,G, E).

В настоящее время с целью идентификации лимфоцитов используют 3 группы методов: иммунофлюоресценция – проточная цитометрия, розетко-образование, иммуноферментный анализ.

Метод проточной цитометрии На клеточной мембране лимфоцитов находится множество гликопротеидов, которые можно обнаружить при проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител. Некоторые из этих гликопротеидов специфичны для определенного типа клеток, например T-, B- и NK-лимфоцитов, разных субпопуляций T-лимфоцитов, моноцитов, и даже для определенных стадий их созревания и дифференцировки. Эти молекулы принято обозначать CD. Определение B-лимфоцитов с помощью проточной цитофлюориметрии основано на выявлении иммуноглобулинов, фиксированных на поверхности клеток, CD19 и CD20. При оценке результатов исследования необходимо учитывать возраст больного. У детей старшего возраста и взрослых B-лимфоциты составляют 10—20% всех лимфоцитов крови, у детей младшего возраста их больше.

Метод розеткообразования основывается на наличии на мембране В – лимфоцита рецептора для Fc–фрагмента иммуноглобулинов и третьего компонента системы комплимента (С3). Они способны образовывать розетки лишь с эритроцитами миши, которые обработаны антителами и в присутствии комплемента (Ем–РОК). Показано, что Ем-рецепторы идентичны выявляемым моноклональными антителами CD22 и присутствуют на зрелых B-лимфоцитах. Таким образом, тест розеткообразования с эритроцитами мыши (Ем-РОК) используют для обнаружения В-лимфоцитов, имеющих рецепторы CD22.

Определение абсолютного количества В-лимфоцитов Абсолютное количество В-лимфоцитов в норме составляет 0,28 – 0,31 *10⁶ /л).

Повышение абсолютного количества В-лимфоцитов наблюдается при: острых бактериальных, грибковые, паразитарные заболеваниях, СПИД (начальный период), хронических заболевание печенки (цирроз, вирусный гепатит), аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, СКВ, ревматизм, коллагенозы), саркоидозе, муковисцидозе, болезни Крона, болезни Вальденстрема, моноклональной гаммапатииии, инфекционном мононуклеозе, хроническом лимфолейкозе, в остром периоде повторной инфекции.

Снижение абсолютного количества В-лимфоцитов наблюдается при: физиологичной гипогаммаглобулинемии у детей (в возрасте 3–5 мес.), врожден-ной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии, новообразованиях иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, состояниях после удаления селезенки, недостаточности гуморального звена иммунитета.

Определение IgG, IgA, IgM методом радиальной иммунодиффузии по Mancini et al основан на том, что образцы исследуемых сывороток поміщують в лунки агара, который содержит антитела к Ig одного из классов IgG, IgА, IgМ в известной концентрации. Иммуноглобулины, дифaундируя из лунок в агар, при взаимодействии с соответствующими антителами будут образовывать кольца преципитации, размер которых находится в тесной зависимости от содержания в сыворотке обследуемого Ig того или другого класса. Уровень сывороточных Ig отображает функциональное состояние В-клеточного звена иммунной системы в ответ на стимуляцию организма антигенными раздражителями.

Повышение концентрации IgА наблюдается при: острой и хронической бактериальной, грибковой, паразитарной инфекции, хронических заболеваниях печенки, циррозе, ревматоидном артрите, СКВ, хроническом лимфолейкозе, миеломной болезни, моноклональной гаммапатии, болезни Вальденстрема, эндотелиоме, остеосаркоме, кандидозе, муковисцидозе, заболеваниях дыхательных путей.

Уменьшение концентрации IgА наблюдается при: физиологичной гипогаммаглобулинемии у детей (в возрасте 3–5 мес.), врожденной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии, новообразованиях иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, состояниях после удаления селезенки, кишечных и почечных синдромах потери белка, острых вирусных, хронических бактериальных инфекциях.

Повышение концентрации IgM наблюдается при: острых и хронических бактериальных, грибковых, паразитарных инфекциях, острых вирусных гепатитах, циррозе, ревматоидном артрите, СКВ, остром и хроническом лимфолейкозе, миеломной болезни, макроглобулинемии Вальденстрема, эндотелиоме, остеосаркоме, кандидозе, муковисцидозе, заболеваниях дыхательных путей.

Уменьшение концентрации IgM наблюдается при: физиологичной гипогаммаглобулинемии у детей (в возрасте 3–5 мес.), врожденной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии, новообразованиях иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, облучение ионизирующей радиацией, состояниях после удаления селезенки, кишечных и почечных синдромах потери белка, хронической вирусной инфекции, недостаточности гуморального звена иммунитета.

Повышение концентрации IgG наблюдается при: острых и хронических бактериальных, грибковых, паразитарных инфекциях, острых и хронических заболевание печенки, циррозе, вирусном гепатите, аутоиммунних заболеваниях, ревматоидном артрите, СКВ, саркоидозе, муковисцидозе, хроническом лимфолейкозе, миеломной болезни, инфекционном мононуклеозе, моноклональной гаммапатии, болезни Вальденстрема, реконвалесценции первичной бактериальной инфекции, при остром периоде повторной инфекции, СПИДе.

Уменьшение концентрации IgG наблюдается при: физиологичной гипогаммаглобулинемии у детей (в возрасте 3–5 мес.), врожденной гипогаммаглобулинемии или агаммаглобулинемии, новообразовании иммунной системы, лечении цитостатиками и иммунодепрессантами, состояниях после удаления селезенки, кишечных и почечных синдромах потери белку, при хронической вирусной инфекции, гемоглобинопатии.

Иммуноглобулин Е (IgE) – класс иммуноглобулинов, обнаруженный в норме в незначительном количестве в сыворотке крови и секретах слизистых оболочек и эндокринных желез. Основная биологическая роль IgE связана с его способностью связываться с поверхностью тучных клеток и базофилов человека. Только эти клетки несут высокоафинный гликопротеиновый рецептор к IgE.

IgE принимает участие в аллергический реакциях I (анафмлактического) типа, а также принимает участие в защитном противогельминтном иммунитете, что обусловлено наличием перекрестного связывания между IgE и антигеном гельминтов.

Определение IgE имуноферментним методом (ELISA-тест). Аллерген, например экстракт пыльцы, иммобилизуют на сорбенте, который потом инкубируют с сывороткой больного. Количество связанного с сорбентом специфического IgE определяют с помощью антител к IgE, которые иммобилизованы в лунках на специальных планшетах.

В норме IgE составляет менее 0,001% от всего иммуноглобулина сыворотки крови. Его концентрация в сыворотке крови взрослого человека составляет не менее 0,05% г/л (приблизительно 100 кЕ/л), что в 1000 раз выше концентрации IgE специфического в сыворотке (приблизительно 10 граммов/л).

Методы для выявления антител и антигенов

1. Методы, основанные на реакции преципитации - образования осадка из нерастворимых комплексов антиген-антитело в растворе, агаре, геле (нефелометрия; простая, двойная и радиальная иммунодиффузия; иммуноэлектрофорез; непрямая преципитация). Таким образом в клинической иммунологии определяются уровни иммуноглобулинов по методу Манчини, происхождение крови или спермы в судебной медицине, количественные и качественные свойства белков в биохимических препаратах. В организме с помощью преципитации нейтрализуются вирусы и бактериальные (например, дифтерийный) токсины. В иммунопатологии за счет преципитации реализуется феномен Артюса (одно из проявлений гиперчувствительности), когда преципитат блокирует микроциркуляцию и тем самым приводит к локальному некрозу.

2. Методы, основанные на реакции агглютинации (прямая и непряма агглютинация) - осаждение клеток, нагруженных антигенами (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, сперматозоидов при диагностике бесплодия), иммуноглобулинами-агглютининами. Применяется в диагностике тифа и туберкулеза, иммунологического бесплодия, определении групп крови (ABO);

3. Методы, основанные на реакции лизиса бывают двух видов: а) реакция связывания комплемента (основывается на потреблении комплемента в двух конкурирующих парных системах антиген-антитело); б) реакция комплементарной фиксации (основывается на потреблении комплемента в двух последовательно реагирующих парных системах антиген-антитело). Таким образом устанавливают уровень антител к вирусам полиомиелита, оспы, эпидемического паротита, герпеса, гриппа или бактерий гонореи, туберкулеза, сифилиса (реакция Вассермана)

4. Методы, основанные на использовании меченых антител и антигенов подразделяются на:

а) иммунофлюоресцентный метод (иммунное окрашивание) - определение антигенов (прямая реакция) или антител (непряма) путем детекции флюоресцирующих (меченых) комплексов. Таким образом определяются популяции и субпопуляции иммуноцитов (метод моноклональных антител), антигены, антитела и потенциальные аллергены в сыворотке и тканях (иммуногистохимическое исследование);

б) иммуноферментный метод - определение антигенов (прямая реакция) или антител (непрямая) путем их взаимодействия, соответственно, с антителом или антигеном, мечеными ферментами. С помощью этого метода можно качественно и количественно определять антигены и антитела, интерлейкины, интерфероны, иммуноглобулины, потенциальные аллергены. Модификациями этого метода является:

- ELISA-тест на ВИЧ - образование послойного "сэндвича" антитело-антиген-антитело;

- Вестерн-блот - проведение иммуноферментного анализа после предыдущего разделения антигенов в геле электрофорезом и перенесение (блоттинг) их на неподвижную бумагу.

Лабораторная диагностика аллергических заболеваний in vitro

Специфические методы аллергодиагностики направлены на:

— выявление свободных антител в сыворотке крови и секретах;

— обнаружение антител, связанных с лейкоцитами (базофилами, нейтрофилами, тромбоцитами и др.);

— определение Т-лимфоцитов, сенсибилизированных к аллергену.