Методы стерилизации растительных объектов и оборудования при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений

Цель работы: ознакомиться с методами стерилизации растительных объектов и оборудования при проведении работ с культурой изолированных клеток и тканей растений.

Теоретические основы

Одним из основных условий успешного культивирования изолированных органов, тканей, клеток и протопластов является соблюдение строгой стерильности, поскольку на искусственных питательных средах хорошо развиваются микроорганизмы, что представляет двойную опасность. Во-первых, в результате жизнедеятельности микроорганизмов может существенно измениться состав питательных сред. Во-вторых, изолированные от растения ткани, клетки и в особенности протопласты легко повреждаются микроорганизмами. Поэтому все опыты проводят в стерильных помещениях – боксах или ламинар-боксах. Стерилизуют бокс, инструменты, посуду, растительный материал, питательные среды, ватные пробки и все другие материалы.

Стерилизация ламинар-бокса. Ламинар-боксы предназначены для культивирования изолированных клеток, тканей и некоторых других работ, требующих стерильности, которая обеспечивается с помощью бактериальных воздушных фильтров. За 10-20 минут до начала работы ламинар-бокс облучают бактерицидными ультрафиолетовыми лампами. Предварительно в ламинар-боксе размещают спиртовую горелку, спички, фарфоровый стакан с 96 %-ным спиртом и колбы со стерильной водой, а при изолировании меристем – бинокулярную лампу. Внутреннюю поверхность ламинар-бокса, лупу, спиртовку обрабатывают 70 %-ным спиртом. Перед началом работы следует вымыть руки с мылом, протереть их спиртом, надеть стерильный халат, завязать волосы стерильной косынкой.

Мытье стеклянной культуральной посуды

Для пассирования постоянных и многих ограниченных, линий клеток подходит стеклянная культуральная посуда, если есть условия для мытья посуды и возможность контроля его качества. Посуду нужно выдержать в растворе нетоксичного детергента, предпочтительно в течение ночи и после этого тщательно промыть проточной, а затем деионизованной или дистиллированной водой.

Стерилизация стеклянной посуды

Пластиковая посуда поступает стерильной, а стеклянную культуральную посуду перед использованием необходимо простерилизовать. Во многих лабораториях проводят массовую стерилизацию всей посуды независимо от ее непосредственного использования для культивирования, что позволяет избежать ошибок при выборе посуды. Стерилизацию лучше проводить в сухожаровом стерилизаторе (160⁰С в течение 1 ч), помещая посуду в контейнеры или заворачивая в фольгу. Завинчивающиеся крышки сосудов стерилизуют отдельно.  Качество посуды, процесс её мытья и выбор детергента следует периодически контролировать. Для этого промывают посуду обычным образом, оценивают чистоту визуально, высушивают, стерилизуют и используют для клонирования клеток в монослое, предпочтительно при низкой концентрации сыворотки (2 — 5 %) или в ее отсутствие.

Стерилизация инструментов. Предварительная стерилизация инструментов (скальпелей, пинцетов, игл и др.) заключается в нагревании их сухим горячим жаром в сушильном шкафу в течение 2 ч при 140 … 160 ^о С. Шприцы, ножницы, пробочные сверла удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под действием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе работы инструменты (пинцеты, скальпели, микробиологические петли) еще раз стерилизуют в ламинар-боксе, помещая в фарфоровый стакан с 96 % этиловым спиртом, обжигая в пламени спиртовки. После этого каждый инструмент помещают между листами предварительно простерилизованной плотной бумаги, сложенной в пачку. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции. Перед повторным употреблением его следует снова простерилизовать спиртом и обжечь. Очень тонкие инструменты (иглы, кусочки лезвий) могут терять свои свойства при обжигании, поэтому их стерилизуют, погружая в спирт.

Стерилизация материалов. Вату, марлю. Ватные пробки, фильтровальную бумагу, стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм в течение 25-30 мин.

Стерилизация растительного материала

С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Nа, сулеймой), бром (бромной водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками (таблица 1).

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5 – 7% раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5 – 8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5 – 5% раствора для обработки любых эксплантов в течение 1 – 20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2 – 3% раствор в течение 10 – 15 минут, а для сухих семян 3 – 5% раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н НСl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1 – 6%. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1 – 3 минут, сухие семена – 30 – 60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой.

Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1% раствор в течение 1 – 3 минут, для корне – и клубнеплодов – до 10 – 20 минут.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2% растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этаномеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин - 80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями. Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10 – 80 мг/л, ампициллин 200 – 400 мг/л, левомицитин и другие.

Стерилизация питательных сред. Разлитые в пробирки или стеклянные колбы питательные среды закрывают ватными пробками или фольгой, завертывают в целлофан и автоклавируют при температуре 120 ^о С и давлении 1 атм в течение 20 мин.

Таблица 1 - Продолжительность стерилизации, мин, исходного растительного материала (по Р.Г. Бутенко, 1999)

Объект	Диацид 0,1 %-ный	Сулема 0,1 %-ная	Гипохлорит Na 5-9%-ный	Пероксид водорода 12%-ный
Семена сухие	15-20	10-15	15-20	12-15
Семена набухшие	6-10	6-8	10-15	6-8
Ткани мясистого корня клубня	20-30	15-25	15-20	-
Ткани одревеснев-шего стебля	20-40	20-25	20-25	-
Листья	1-3	1-3	3-6	3-5
Апексы	1-10	1-7	3-15	2-7

Ход выполнения работы:

Материалы и оборудование: чашки Петри, колбы с дистиллированной водой, штативы с пробирками, заполненными питательными средой, препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, вата, марля, бумага: фильтровальная и целлофановая.

Ход выполнения работы:

1. Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при t° = 170-200С° в течение 2 часов.

2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав.

3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течение 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1 – 0,2 атм. Довести давление в стерилизационной до 1 атм., включить автоматический режим.

4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1 – 1,2 атм.

5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.

6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

Способы стерилизации растительных эксплантов

Материалы и оборудование: стерильные чашки Петри, колбы с автоклавированной дистиллированной водой, флаконы со стерилизующими растворами, зерновки пшеницы и тритикале, ламинар – бокс, флаконы с 96 % спиртом, вата, спиртовка, пинцеты, фильтровальная бумага.

Ход выполнения работы.

1. Отобрать 30 здоровых зерновок пшеницы или тритикале.

2. В ламинар – бокс поместить семена в чашки Петри со стерилизующими растворами по 5 семян в каждую (6% хлорамин, 6% гипохлорит кальция, 96% спирт, сулема 0,1%, ампициллин 400 мг/л, вода). Время стерилизации подобрать экспериментально.

3. Отмыть семена от стерилизующих растворов дистиллированной автоклавированной водой.

4. Поместить семена для проращивания в стерильные чашки Петри на стерильную фильтровальную бумагу в небольшое количество стерильной дистиллированной воды. Чашки Петри закрыть и перенести в термостат для проращивания.

5. Результаты опыта зарисовать через неделю. Сделать выводы об эффективности стерилизующих растворов.

Контрольные вопросы:

1. Методы стерилизации растительных объектов.

2. Методы стерилизации оборудования.

3. Какую опасность представляет несоблюдение строго стерильности?

4. От чего зависит продолжительность стерилизации растительных объектов, привести примеры.

5. Стерилизующие растворы, рабочие концентрации, их приготовление.

Лабораторная работа № 3

Приготовление растворов солей (макро- и микроэлементы), витаминов, фитогормонов

Цель работы: ознакомиться с принципами приготовления растворов солей (макро- и микроэлементы), витаминов, фитогормонов для питательных сред, освоить методику приготовления маточных растворов микро- и макросолей питательной среды Мурасиге-Скуга, а также других сред.