Посадка и культивирование эксплантов на агаризованной среде

Цель работы: Изучить теоретические основы способов выращивания куллусных культур и освоить практические навыки работы по их выращиванию.

Теоретические основы

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса.

Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску. Темно-коричневая окраска чаще всего появляется при старении каллусных клеток и связана с накоплением фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от этих соединений в питательные среды вносят антиоксиданты. Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции:

• рыхлой, состоящей из сильно обводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие клетки;

• средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

• плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее вкаллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины – пролиферацию( деление) дедифференцированных клеток.

Каллусная клетка в результате деления, которого возникла каллусная ткань или каллус, представляет собой один из типов клеточной дифференцировки, присущей всему растению. Для растения каллус является тканью, которая защищает место поранения, накапливает питательные вещества для анатомических структур или утраченного органа. Дифференцированные клетки объединяются в растении, в ткани и выполняют определенные функции. Клетки различаются не только функционально, но и морфологически.

На питательных средах с большим содержание ауксинов (2,4Д) клетки экспланта дедифференцируются и переходят к пролиферации. Особенности дедифференцировки клеток экспланта зависят от генетики и эпигенетики экспланта. Клетки утрачивают прежние функции и морфологию. Причем, чем меньше структурно и химически дифференцирована клетка, тем легче получить каллус. В клетке, готовящейся к делению, стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ДНК, исчезают специфические тканевые белки – антигены, синтезируются новые, специфичные для каллусных клеток. Меняется активность структурных генов и белкового аппарата клеток. Дедифференциация специализированных клеток начинается с обогащения их элементами цитоплазмы: микротрубочками, мембранами ЭПС и комплекса Гольджи, рибосомами, исчезают хлоро– и хромопласты, продукты их деятельности; может образоваться много ядер или увеличиться число хромосом; укрепляются вакуоли.

Каллус, выращиваемый поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенную структуру. Клетки каллуса либо бесцветны, либо имеют желтоватый оттенок. В зависимости от происхождения и условий культивирования различают каллусы: рыхлые, с сильно оводненными, легко отделяющимися друг от друга клетками; средней плотности, с зонами меристематической активности; плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов.

В биотехнологии, для отработки методик культивирования, чаще всего используют те виды растений, которые и в обычных условиях легко укореняются, регенерируют, образуют каллус. Поэтому большинство методов получения и культивирования каллуса разработано для табака. Каллусы можно получить практически из любой части растения, так как клетки табака легко дедифференцируются и переходят к пролиферации. Для культивирования каллусов из листьев табака используют среду Мурасиге-Скуга с добавлением ауксинов (2,4 Д).

Каллусы из различных органов пшеницы на искусственных питательных средах впервые были получены в 1968 году. Их можно использовать для изучения солеустойчивости, устойчивости к температурному стрессу, получения суспензий и протопластов.

Для индукции каллусогенеза обычно используют стерильные пробирочные растения, выращенные из зародышей на средах без гормонов.

Растения для получения каллусов можно вырастить в теплице. Для этого набухшие семена помещают на 5 недель в холодную камеру на яровизацию при 2^оС, проростки высаживают в вегетационные сосуды и выращивают до достижения молочною спелости. Незрелые зародыши выделяют и переносят на питательные среды.

Каллусы можно получать из разных частей растения, в том числе из кончиков корней. Образование каллуса происходит в области первичных и вторичных меристем. Процесс калусообразования зависит от размера экспланта. Оптимальная величина экспланта 5-10 мм³ и масса 20-100 мг.

Многие ткани имеют физиологическую полярность. Поэтому каллус лучше образуется на той стороне экспланта, которая ближе к апикальным меристемам корня. Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на среду горизонтально, тогда как сегменты стебля лучше формируют каллус, если их поместить вертикально.

Для культивирования на питательных средах лучше использовать стерильные корешки, полученные при проращивании семян в стерильных условиях.

Для культивирования стерильных проростков необходимо использовать ламинар – боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питательную среду без заражения микроорганизмов.

Все поверхности ламинара обрабатываются 96% спиртом, простерилизованные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ – излучение. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар – боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатывают 96% спиртом. Пинцеты, скальпели и препаровальные иглы помещают в стакан с 96% спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.

Техника работы в ламинаре при культивировании стерильных проростков

Материалы и оборудование: ламинар- бокс, пробирки с питательными средами, стерильные препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, флакон с 96% спиртом, спиртовка, вата, 6% раствор хлорамина, колбы с автоклавированной дистиллированной водой, чашки Петри, зерновки пшеницы.

Ход выполнения работы:

1. Отобрать 10 здоровых зерновок пшеницы, поместить в 6% раствор хлорамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой.

2. Зерновку поместить на стол ламинара бороздкой вниз.

3. Одной препаровальной иглой придерживать зерновку, другой – надрезать оболочку вокруг зародыша.

4. Боковой частью иглы надавить на зародыш (на границе с эпидермисом) и вычленить его из зерновки.

5. Зародыш поместить в чашку Петри со стерильной дистилированной водой.

6. Взять из штатива пробирку с питательной средой, обжечь горлышко над спиртовкой, снять пробку. Пробирку держать открытой частью от себя.

7. Препаровальной иглой перенести зародыш на поверхность питательной среды щитком вниз (не заглублять).

8. Пробирку и горлышко пробирки обжечь на пламени спиртовки, пробирку закрыть. с зародышами поставить в штатив и перенести на стеллаж в культуральную комнату.

9. Пробирку с зародышами поставить в штатив и перенести на стеллаж в культуральную комнату.

10. Проростки пшеницы зарисовать через 1 – 2 недели. Оценить качество посадки.

Получение каллусов из листьев табака

Материалы и оборудование. Растения табака, 6% раствор хлорамина, колбы со стерильной дистиллированной водой, чашки Петри со стерильной питательной средой для индукций каллусогенеза.

Ход работы

1. Листья табака поместить в стерилизующий раствор на 5 минут, затем промыть стерильной дистиллированной водой 3 раза.

2. Стерильным скальпелем вырезать срединную жилку листа с участком паренхимы: длиною 1,5-2 см, шириной 1 см.

3. Поместить экспланты на питательные среды (перед каждой манипуляцией инструменты обрабатывать спиртом и обжигать на пламени спиртовки).

4. Чашки Петри с эксплантами перенести в термостат для индукций каллусогенеза при температуре 25 + 2^о С.

5. Результаты зарисовать через 2-4 недели.