Регуляция активности ферментов

Активность фермента определяют по скорости реакции, катализируемой ферментом, при стандартных условиях измерения (оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом). О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Одна стандартная единица активности фермента (Е или U) — такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль вещества за 1мин.

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 моль/с. 1 U(Е) фермента соответствует 16,67 нкат.

Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка).

Молярная активность (число оборотов, каталитическая константа) равна числу единиц активности фермента, деленному на количество фермента, выраженное в микромолях. Молярная активность указывает, сколько молекул субстрата превращается одной молекулой фермента за 1 мин.

Регуляция скорости ферментативных реакций в клетке – основной механизм не только контроля и координации метаболических путей, но и роста и развития клетки, а также ее ответа на изменение окружающей среды.

1. Контроль количества фермента.

Когда субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен, скорость реакции ограничивает концентрация фермента. Количество фермента в клетке определяется соотношением скоростей его синтеза и распада.

В клетках имеются конститутивные ферменты - постоянно присутствующие в клетках (в отличие от индуцируемых ферментов). При выращивании бактерий на среде, содержащей глюкозу, замена ее на лактозу (индуктор) приводит к индуцированному синтезу фермента класса -галактозидаз лактазы, расщепляющей лактозу. Количество фермента в клетке зависит от наличия продукта реакции, катализируемой данным ферментом, причем продукт реакции вызывает торможение синтеза фермента в результате репрессии. Этот способ регуляция скорости ферментативной реакции является более медленным процессом (проявляется спустя несколько часов), чем регуляция активности фермента (практически мгновенный ответ).

2. Контроль активности фермента.

2.1. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было обнаружено А. Я. Данилевским еще в XIX в.

Активаторами ферментов являются ионы многих металлов (слайд 2). Ионы Fe активируют цитохромы, каталазу, пероксидазу; ионы марганца – фосфоглюкомутазу, холинэстеразу; ионы кальция – липазу. Анионы в физиологических концентрациях обычно неэффективны или оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Некоторые анионы также способны активировать ферменты, например, a-амилаза слюны активируется ионами хлора. Ионы металлов могут входить в состав простетической группы фермента, способствовать присоединению кофермента к апоферменту, обеспечивать становление четвертичной структуры фермента, облегчать образование фермент-субстратного комплекса. Металлы нередко выступают в роли аллостерических модуляторов.

Активаторами ферментов могут быть разнообразные вещества: желчные кислоты повышают активность панкреатической липазы; оксидоредуктазы активируются соединениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин).

Ингибиторы тормозят действие ферментов.

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся фермент-ингибиторный комплекс EI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES, не распадается с образованием продуктов реакции. Константа диссоциации комплекса EI, или ингибиторная константа К_i, представляет отношение констант обратной и прямой реакций:

По характеру своего действия ингибиторы подразделяются на обратимые и необратимые. В основе такого деления лежит прочность соединения ингибитора с ферментом.

Обратимые ингибиторы — это соединения, которые нековалентно взаимодействуют с ферментом и могут отделяться от фермента.

Обратимое ингибирование может быть конкурентным. Конкурентный ингибитор имеет структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько от нее отличающуюся. Он конкурирует с субстратом за связывание в субстратсвязывающем участке активного центра. Конкурентное ингибирование можно ослабить или полностью устранить, повысив концентрацию субстрата. Конкурентный ингибитор увеличивает К_m, но не изменяет V_max.

Пример: фермент сукцинатдегидрогеназа (СДГ) дегидрирует сукцинат, превращая его в фумарат. Малонат, который структурно похож на сукцинат, связывается в активном центре СДГ, но не может дегидрироваться. Степень торможения будет определяться соотношением концентраций малоната и сукцината, а не абсолютной концентрацией ингибитора. Это ингибирование по типу метаболического антагонизма.

Метод конкурентного торможения нашел широкое применение в медицинской практике. Сульфаниламиды – препараты, используемые для лечения инфекционных болезней – это структурные аналоги парааминобензойной кислоты, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты - составной части ферментов бактерий. Сульфаниламид вытесняет пара-аминобензойную кислоту из комплекса с ферментом и тем самым блокирует действие фермента. Нарушение синтеза нуклеиновых кислот приводит к гибели микроорганизмов.

При обратимом неконкурентном ингибировании ингибитор не конкурирует с субстратом за активный центр фермента. Cубстрат и ингибитор связываются с разными центрами. Увеличение концентрации субстрата не препятствует связыванию ингибитора. Этот тип ингибирования наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Т.к. субстрат и ингибитор связываются с разными центрами, то возможно образование как комплекса фермент-ингибитор, так и комплекса фермент-ингибитор-субстрат, который может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем фермент-субстратный комплекс.

Неконкурентный ингибитор уменьшает V_max, а К_m не меняется.

Известно бесконкурентное ингибирование, когда ингибитор связывается с ферментом также в некаталитическом центре, однако не со свободным ферментом, а только с ES-комплексом в виде тройного комплекса.

Бесконкурентный ингибитор уменьшает V_max и увеличивает К_m.

Любые агенты, вызывающие денатурацию белка, приводят к необратимой инактивации фермента. Но она не связана с механизмом действия ферментов.

Необратимые ингибиторы — это соединения, которые могут специфически связывать функционально важные группы активного центра, образуя ковалентные прочные связи с ферментом.

Неконкурентное необратимое ингибирование вызывается тяжелыми металлами (ртуть, мышьяк, свинец и др. присоединяются к сульфгидрильным группам полипептидной цепи), солями синильной кислоты, оксидом углерода (II) (присоединяются к железосодержащим простетическим группам).

При конкурентном необратимом торможении ингибитор, обладающий структурным сходством с субстратом, соединяется с ферментом, подменяя собой субстрат.

Диизопропилфторфосфат структурно близок к ацетилхолину и присоединяется вместо него к ферменту ацетилхолинэстеразе (АХЭ). Он блокирует активный центр фермента, фосфорилируя радикал серина. Диизопропилфосфосерин прочнее ацетилсерина, распадается медленно, и активный центр фермента надолго блокирован. Диизопропилфторфосфат приводит к утрате способности нейронов проводить нервные импульсы. Симптомы отравления органическими фторфосфатами связаны в основном с необратимым ингибированием АХЭ.

Терапевтическое действие аспирина как жаропонижающего и противовоспалительного средства объясняется тем, что аспирин ингибирует один из ферментов, катализирующий синтез простагландинов (ПГ). Простагландины - вещества, участвующие в развитии воспаления. Ингибирование обусловлено ацетилированием аминогруппы фермента простагландинсинтетазы.

Недавно обнаружены необратимые инактиваторы ферментов, возникающие из инертных соединений после их взаимодействия с каталитическим центром фермента. Такие необратимые ингибиторы полностью блокируют активный центр фермента. Поэтому их называют ингибиторами типа «самоубийц».

Специфическую группу составляют ингибиторы белковой природы – антиферменты. Они блокируют действие фермента за счет белок-белковых взаимодействий, в результате чего закрывается активный центр фермента. Ингибитор белковой природы – гликопротеин a1-антитрипсин, получаемый методом генной инженерии из пекарских дрожжей, используется для лечения эмфиземы легких. Он блокирует действие эластазы, выделяемой в норме нейтрофилами легочной ткани.