Дефекты изображения

К дефектам изображения относятся хроматическая и сферическая аберрации, астигматизм, кома, кривизна изображения и дисторсия.

Хроматическая аберрация обусловлена тем, что при использовании немонохроматического света лучи с меньшей длиной волны преломляются линзой сильнее, чем лучи с большей длиной волны; в результате возникают изображения разной величины, располагающиеся в различных плоскостях.

Сферическая аберрация связана с различным преломлением монохроматических лучей, проходящих через различные участки линзы. В случае световых пучков с довольно большим диаметром к сферической аберрации добавляются дефекты асимметрии (кома), в результате которых изображение деталей образца, располагающихся на некотором расстоянии от оси линзы, получается размытым. Вследствие астигматизма при прохождении через линзу пучка лучей от светящегося точечного источника, расположенного вне оптической оси, образуются две фокусные линии, находящиеся в разных плоскостях, а изображение точки в промежуточных плоскостях имеет форму круглого или эллиптического пятна рассеяния.

Аберрация, называемая дисторсией, связана с различным увеличением деталей объекта, находящихся на разном расстоянии от оптической оси, так что изображения прямых линий оказываются искривленными и нарушается подобие в геометрической форме между предметом и его изображением. И наконец, возможно искривление изображения, при котором точечные изображения, возникающие от плоского объекта, перпендикулярного оптической оси, лежат не на плоскости, а на искривленной поверхности.

В зависимости от степени исправления аберраций и области спектра, в которой они работают, объективы микроскопов делятся на ахроматы, апохроматы, планахроматы и планапохроматы. У ахроматических объективов исправлена сферическая аберрация, кома и хроматическая абберация для двух цветов, наиболее важных для визуального наблюдения; кривизна изображения не исправлена. Апохроматические объективы отличаются более высокой степенью исправления сферической аберрации и комы, а также обспечивают более правильную цветопередачу. В сочетании с компенсационными окулярами эти объективы дают высокое качество изображения и особенно подходят для больших увеличений и микрофотографирования. Планахроматы и планапохроматы скорректированы соответственно так же, как ахроматические и апохроматические объективы, и, кроме того, у них исправлена кривизна изображения.

Методы наблюдения

Большинство микроскопических исследований проводят с применением светлопольного (вертикального) освещения (см. рис. 2) как в отраженных, так и в проходящих лучах. Для дополнительного повышения контрастности применяют другие виды освещения.

Метод косого освещения

При этом методе в создании изображения участвуют преимущественно косые лучи, не параллельные оптической оси системы. Повышение контраста при косом освещении связано, во-первых, с увеличением роли дифрагированных на разных элементах структуры объекта лучей в формировании изображения и, во-вторых, с образованием теней от рельефа поверхности объекта. Косое освещение достигается обычно включением между объективом и полупрозрачной пластинкой призмы косого освещения или смещением, по отношению к оптической оси системы апертурной диафрагмы, вращением которой изменяется плоскость падения света на объект.

Метод темнопольного освещения

При темнопольном освещении в отличие от светлопольного свет не проходит через объектив. Пройдя через кольцевую диафрагму, установленную после конденсора, свет отражается от кольцевого зеркала, установленного на месте полупрозрачной пластинки, и попадает на зеркальную отражающую параболическую поверхность специального конденсора темного поля, который устанавливается на объектив или монтируется в одной оправе с ним (эпиобъектив). Такая система создает косое освещение объекта, при котором освещающий пучок имеет большую апертуру, чем в случае светлопольного освещения. Темнопольное изображение является обратным по отношению к светлопольному (углубления и выступы становятся светлыми на однородном темном фоне), поскольку в объектив попадают лучи, отраженные неровностями поверхности. Этот тип освещения дает высококонтрастные изображения, четко выявляет зернистую структуру материала, границы между отдельными фазами и дефекты на отполированной поверхности микрошлифа (царапины, поры, трещины).

Исследование в поляризованном свете

Поскольку большинство металлов, а также металлических и неметаллических фаз являются оптически анизотропными, часто целесообразно использовать поляризованный свет. С этой целью перед коллекторной линзой помещают поляризатор (призму Николя или поляроид). Создающийся в поляризаторе плоскополяризованный свет после отражения от объекта проходит через анализатор, расположенный между объективом и окуляром или над окуляром. Если объект оптически изотропен, то при соответствующем взаимном положении поляризатора и анализатора (“положение скрещения”) можно добиться полного поглощения света. Однако если кристаллиты одной или разных фаз оптически анизотропны, то при скрещенных полярофильтрах полного поглощения не происходит и отдельные кристаллы оказываются светлыми, т. е. получается видимое контрастное изображение. Эта преимущественная освещенность отдельных кристаллов объясняется эффектами эллиптической поляризации и вращением плоскости поляризации.

Метод фазового контраста

Метод фазового контраста и его разновидность т. н. метод “аноптрального” контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости (“амплитудный рельеф”). Такое изображение называется фазово-контрастным.

Для его получения в переднем фокусе конденсора устанавливается апертурная диафрагма, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае не отклоненные в образце лучи от осветителя, дающие изображение диафрагмы, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на 1/4 длины волны света. В то же время лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в образце, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо, и не претерпевают дополнительного сдвига фазы. С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или , и в результате интерференции света в плоскости изображения они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры образца. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклоненными через фазовое кольцо. Для подобных частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

Метод интерференционного контраста

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается; один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, а второй — мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей , которая выражается формулой = N = (п_о – n_m)d, где n₀, п_т – показатели преломления частицы и окружающей среды, d – толщина частицы, N – т. н. порядок интерференции, – длина волны света.

Метод интерференционного контраста в некоторых отношениях сходен с методом фазового контраста – оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод позволяет наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и часто применяются именно с этой целью. Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается главным образом в возможности, используя компенсаторы, с высокой точностью измерять разности хода, вносимые микрообъектами. К интерференционной микроскопии обычно относят также методы использования микроинтерферометров.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия или флуоресцентная микроскопия заключается в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. При этом методе в оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат с образцом и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя или на фоточувствительный слой только свет люминесценции. Метод широко применяется. в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии.

Стереомикроскопы

Бинокулярные тубусы, используемые в обычных микроскопах, при всём удобстве наблюдения двумя глазами не дают стереоскопического эффекта: в оба глаза попадают в этом случае под одинаковыми углами одни и те же лучи, лишь разделяемые на два пучка призменной системой. Стереомикроскопы, обеспечивающие подлинно объёмное восприятие микрообъекта, представляют собой фактически два микроскопа, выполненных в виде единой конструкции так, что правый и левый глаза наблюдают объект под разными углами. Наиболее широкое применение такие микроскопы находят там, где требуется производить какие-либо операции с объектом в ходе наблюдения.

Коротковолновая и длинноволновая микроскопия

Коротковолновая и длинноволновая микроскопия используют для наблюдения невидимые глазом лучи. Изображения в этих лучах получают либо с использованием электронно-оптических преобразователей, либо на чувствительных к этим лучам экранах. Применение ультрафиолетовых и рентгеновских лучей позволяет повысить разрешение изображений, а применение инфракрасных лучей в основном связано с их свойством проникать через некоторые непрозрачные для других лучей среды.

Ультрамикроскопия

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип, что при наблюдении пылинок в луче солнечного света – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. Этим методом можно обнаружить (но не “наблюдать” в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов (до 2 нм). Форму и точные размеры частиц с помощью этого метода определить невозможно. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Конфокальная микроскопия

Конфокальная микроскопия – один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеяного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования - движения образца или перестройки оптической системы. Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек в основном задерживается диафрагмой.

Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Для этого используют светоделительную пластинку, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом.

Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия

Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ) – Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) основывается на получении изображения при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В пределах ближнего поля затухающий свет не ограничен дифракцией, и возможно получение информации об объектах нанометрового порядка. Это явление позволяет получать изображения за пределами дифракционного барьера и получать разрешение, недостижимое средствами обычной оптической микроскопии (до 10 нм).