8.1. Методи контролю Визначення концентрації біомаси

Концентрацію біомаси визначаємо за оптичною густиною клітинної суспензії із наступним перерахунком на абсолютно суху біомасу у відповідності з калібрувальним графіком.

Культуральна рідина розводиться дистильованою водою у співвідношенні 1:9. Суміш збовтується, потім вимірюється оптична густина (при 540 нм), отримані дані перераховують за калібрувальним графіком [13].

Визначення концентрації цільового продукту

Концентрацію цільової речовини визначають методом обернено-фазової рідинної хроматографії високого тиску.

Використовується колонка (4,6 х 250 мм, 5 мкм розмір часточок) зі швидкістю потоку 0,385 мл / хв. Рухома фаза А водний 0,2 % розчин трифтороцтової кислоти, а рухома фаза В – 0,078% розчин три хлороцтової кислоти в ацетонітрилі. Елюцію проводять за лінійним градієнтом від 20 до 60% фази В по фазі на 33 хв. Контролюють за допомогою діодного множинного детектора, встановленого на 488 нм. Доксорубіцин концентрацією 10 мкг/мл розчинений в метанолі використовують в якості стандарту для визначення кількості цього метаболіту в ізольованих культурах [13].

Визначення концентрації джерела вуглецю

Суть методу визначення концентрації джерела вуглецю полягає в утворенні Cu(OH)₂, при змішуванні робочих розчинів Фелінга І та Фелінга ІІ, який легко відновлюється до вільної міді альдегідної групи глюкози. Мідь, яка виділяється, відновлює KI до вільного йоду, який відтитровують тіосульфатом натрію. Як індикатор використовується крохмаль.

Для культивування S. peucetius використовується поживне середовище джерелом вуглецю в якому є глюкоза. Для визначення глюкози, в колбу вноситься 5 – 9 мл розчину, що досліджується і доводиться дистильованою водою до загального об’єму 10 мл.

Додають по 10 мл розчину Фелінга І і Фелінга ІІ. Колбу ставлять на нагрівник та кип’ятять 2 хвилини. Після охолодження додають 15 – 20 мл 20 % сірчаної кислоти і 3 г йодистого калію. Виділений йод титрують 0,1 н розчином тіосульфату. Коли розчин йоду починає світлішати, додають 2 – 3 краплини крохмалю і продовжують титрувати до зникнення синього забарвлення і виділення синього осаду. Кількість міді, яка пішла на реакцію з глюкозою, визначають за формулою:

Сu = ((a − b) × k × 6,36) / C, де

а – кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування досліджуваного розчину, мл;

b – кількість 0,1 н розчину тіосульфату, яка пішла на титрування контрольного розчину, мл;

k – поправочний коефіцієнт, k = 1;

6,36 – кількість мл Cu, яка відповідає 1 мл 0,1 н тіосульфату;

С – кількість досліджуваного розчину, яка пішла на титр, мл [13].

Визначення концентрації джерела азоту

Метод Несслера – найбільш загальноприйнятий і поширений для визначення вмісту аміаку і амонійних солей. Cуть методу полягає в утворенні колоїду, пофарбованого в червоно-бурий колір, при взаємодії аміаку і амонійних солей з реактивом Несслера. Цей реактив є лужним розчином меркурійодидакалію.

Забарвлення, що виникає, поглинає випромінювання в широкому діапазоні довжин хвиль і в певних умовах інтенсивність забарвлення пропорційна кількості амонію. Фотометрують при 400 – 425 нм (для кількостей < 0,2 мг NH3) і при 550 – 580 нм (для ~ 1 мг). При визначенні мікрограмових кількостей азоту оптична густина розчинів зберігається постійною протягом 6 год. Якщо реакція протікає довше 15 – 20 хв., то при вмісті азоту > 1 мг може спостерігатися опалесценція або помутніння розчину [13].

Аналіз азоту за методом К’єльдаля є найпоширенішим методом. Метод включає в себе кілька основних етапів: відбір і підготовку проб,мокре озолення, відгонку з парою і визначення концентрації амонію (фотометрично або титрометрично) [6].

Перший етап включає відбір і підготовка проб. Необхідна умова отримання точних результатів аналізу за К’єльдалем є ретельна підготовка зразків. Процедура підготовки проб повинна забезпечувати гомогенізацію зразка, розмір часток в аналізованих пробах не повинен перевищувати 1 мм. Однорідність зразка підвищує відтворюваність методу, а також дозволяє зменшити об'єм проби. Зазвичай при використанні часток малих розмірів підвищується швидкість озолення. Зважування зразків для подальшого аналізу повинно проводитися на аналітичних вагах з точністю до 0,1 мг. Зразки повинні бути, або попередньо висушені, або зразки з точно встановленим вмістом вологи [6].

Другий етап –це мокре озолення. Це тривалий етап у методі К’єльдаля, в результаті якого відбувається повне "спалювання" зразка в сірчаній кислоті. Однак використовувати для озолення чисту сірчану кислоту недоцільно через низьку швидкість протікання процесу. Швидкість озолення і руйнування зразка залежать не тільки від властивостей кислоти, але і від температури обробки. Чим вище температура, тим менше часу йде на розкладання. При використанні чистої сірчаної кислоти температура озолення обмежується, восновному, її точкою кипіння (338 °С), в той час як для повного розкладання необхідна більш висока температури. Швидкість мокрого озолення можна значно збільшити за рахунок додавання солей і каталізаторів. У класичному випадку длякожного грама зразка необхідно 25 мл кислоти і кілька годин для проведення розкладання [6].

Відгонка з парою є третім етапом. Отриманий після стадії розкладання прозорий розчин не годиться для безпосереднього визначення в ньому амонійного азоту з великого вмісту компонентів, що заважають. Для відділення амонійного азоту він переводиться в аміачну форму (додаванням лугу) і відганяється з парою на спеціальних приладах, званих дистиляторами.

Четвертий етап –визначення вмісту амонійного азоту. Перерахунок на вміст білка здійснюється по відомому коефіцієнту, який в загальному випадку дорівнює 6,25, але може дещо відрізнятися для різних типів білка. Переганяється з парою аміак збирається в колбі, в яку попередньо поміщають розчин борної або сірчаної кислоти з відомою нормальністю. Отриманий чистий розчин бората або сульфату амонію можна легко відтитрувати звичайним бюреточнии титруванням [6].