3. Выбор принципа работы автоматизированного иммунологического экспресс анализатора.
3.1 Общие принципы анализа
Для определения с высокой специфичностью различных веществ используют способность AT к комплиментарным высокоспецифичным реакциям Общий принцип данных реакций прост: тем или иным способом получаются AT определенной аффинности к данному АГ (веществу, концентрацию которого определяют). При добавлении наработанных AT в исследуемую пробу происходит реакция взаимодействия АГ-АТ, направление которой определяется соответствующими константами реакции и концентрациями веществ. При условии избытка AT определенный процент имеющихся в пробе АГ окажется связанным за определенное время течения реакции. Тогда, найдя концентрацию продукта реакции, т.е. комплекса АГ-АТ, можно найти исходную концентрацию АГ. Это делается, как и во всех методах, с использованием калибраторов (стандартов) и построением стандартной кривой «сигнал - концентрация», то есть по сути своей эмпирически на основе статистических данных.
В редких случаях реакция АГ-АТ превращается в реакцию преципитации, продукт которой выпадает в осадок. Определение его не составляет труда с использованием нефелометрии или электрофореза.
В остальных случаях AT приходится маркировать специальными метками, детектирование которых позволяет установить концентрацию комплекса АГ-АТ Метки должны удовлетворять следующим требованиям:
Иметь небольшие размеры, чтобы не закрывать эпитопов AT, на которые они нанесены
Обладать стабильностью, достаточной для длительного хранения реактива
Детектироваться с помощью простой и быстрой реакции
Независимо от типа метки, используют два вида иммунохимических реакций: реакцию конкурентного типа и «сэндвич»-реакцию. Рассмотрим их более подробно.
3.2 Реакция конкурентного типа
Суть данной реакции в том, что за ограниченное количество специфичных AT к определенному АГ (веществу), содержащихся в реактиве, конкурируют меченые АГ реактива и исследуемые АГ образца. В результате интенсивность детектируемого сигнала, получаемого в ходе реакции, обратно пропорциональна количеству АГ в образце пациента.
Конкурентный метод ИФА состоит из 3 этапов:
Специфическая конкурентная сорбция антигенов пробы и антигенов, меченных ферментом.
Рисунок 2. Специфическая конкурентная сорбция.
Стадия ферментативной реакции (с промывкой лунки после сорбции).
Рисунок 3. Стадия ферментативной реакции.
Фотометрическая регистрация ферментативной реакции.
Рисунок 4. Фотометрическая регистрация ферментативной реакции.
Применяется конкурентный метод для регистрации не больших молекул: гормонов, лекарств и др.
Не большое число стадий конкурентного метода позволяет автоматизировать процесс.
И, следовательно, используется данный метод в полуавтоматизированных и полностью автоматизированных иммуноферментных анализаторах.
3.3 Реакция «сэндвич» типа
В ходе данной реакции используются два типа специфичных AT, чувствительных к разным эпитопам исследуемого АГ образца. Первое AT связано с твердой фазой , ко второму AT прикреплена метка. В результате реакции получается «пирог», в центре которого находится исследуемый АГ. Схема реакции приведена ниже. Сигнал, получаемый при детектировании сигнала, прямо пропорционален концентрации определяемого АГ.
Рисунок 5. Схема принципа реакции «сэндвич» типа.
Недостаток данного типа реакции в том, что при высоких концентрациях АГ возникает так называемый «hook-эффект» (по форме кривой «сигнал-концентрация»), заключающийся в парадоксальном снижении детектируемого сигнала при высоких концентрациях определяемого вещества. Причину «хук-эффекта» демонстрирует рисунок, приведенный ниже.
Рисунок 6. Схема появления «хук-эффекта».
Как видно из рисунка, высокая концентрация АГ ведет к тому, что АГ связывает все AT так, что «сэндвич» комплекс не может образоваться. Это происходит из-за того, что энергетически выгоднее система АТ1-АГ + АТ2-АГ, чем АТ1-АГ-АТ2.
Для детектирования сигнала при использовании любого типа реакции необходимо отделить комплекс АГ-АТ от реактивов (свободных меток). Для этого обычно используют твердофазную сепарацию. Твердая фаза реактива - составная часть реактива, имеющая твердое фазовое состояние. AT реактива (в случае «сэндвич» метода - одно из AT) прикрепляют к поверхности твердой фазы, что удерживает комплекс АГ-АТ (или АТ-АГ-АТ) от удаления при промывке. В ходе промывки из зоны реакции (кюветы, пробирки и т.д.) удаляются остатки реактива и пробы и в зоне реакции остается только продукт реакции, несущий метки. Далее метки считываются в ходе дополнительной реакции, в результате чего определяется концентрация продукта реакции, а значит и исследуемого вещества.