Глава 7 Стволовые клетки в генной терапии

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Гены, которые несут хромосомы, являются основными физическими и функциональными единицами наследственности. Гены представляют собой специфические последовательности, которые содержат инструкции для постройки белков. Хотя генам уделяется много внимания, это белки, которые выполняют большинство жизненных функций и даже являются составной частью большинства клеточных структур. Когда гены изменены так, что закодированные белки не в состоянии выполнять свои обычные функции, это может привести к генетическим нарушениям.

Генная терапия – это включение генов в клетки и ткани человека для лечения и наследственных заболеваний, при котором дефектный мутантный аллель заменяется.

ПРИНЦИПЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Генная терапия появилась относительно недавно, и до сих пор является экспериментом в подходе к лечению болезней человека. В то время, как традиционная лекарственная терапия подразумевает введение химических веществ, которые были изготовлены вне тела, генная терапия использует совсем другой подход, направляя собственные клетки пациента для производства и доставки терапевтического агента. Инструкции для этого содержатся в терапевтическом трансгене (новый генетический материал, введенный в организм пациента). Генная терапия использует генную инженерию - введение или удаление специфических генов с помощью методов молекулярной биологии, физически манипулируя генетическим материалом для измения или дополнения функции аномального гена, предоставляя копию нормального гена, непосредственно исправляя такой ген, или заменяя его на ген, который добавляет новые функции или регулирует работу других генов.

Клинические попытки применить технологии генной инженерии в лечении заболеваний человека начались с 1989 года. Первоначально клинические испытания генной терапии были сосредоточены на раке, инфекционных заболеваниях или расстройствах, в которых только один ген является дефектным, таких как муковисцидоз. Однако все чаще предпринимаются усилия, направленные на сложные, хронические заболевания, которые связаны с повреждениями более одного гена. Среди наиболее известных примеров болезни сердца, недостаточное кровоснабжение конечностей, артрит и болезнь Альцгеймера. Потенциальный успех технологии генной терапии зависит не только от доставки терапевтического трансгена в соответствующие человеческие клетки-мишени, а также от способности гена функционировать должным образом в этой клетке. В обоих направлениях возникли серьезные технические проблемы.

ВИДЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Исследователи генной терапии использовали две основные стратегии для доставки терапевтических трансгенов к месту назначения (рис.7.1).

Прямая доставка

Во-первых, "непосредственно" вставить ген в человека. Вирусы, которые были изменены, чтобы предотвратить заражение, часто используются в качестве транспортного средства для доставки гена в определенные типы клеток человека, во многом таким же способом, как и обычные вирусы заражают клетки. Этот способ доставки является довольно неточным и ограничивается конкретными типами клеток человека, так как вирусное транспортное средство может инфицировать. Например, некоторые вирусы, обычно используемые в качестве средств доставки гена, могут только заразить клетки, которые активно делятся. Это ограничивает их полезность в лечении заболеваний сердца или мозга, потому что эти органы в значительной степени состоят из неделящихся клеток. Невирусные транспортные средства для непосредственной доставки генов в клетки также изучают, в том числе использование обычной ДНК и ДНК, з ащищенных жировыми молекулами, известными как липосомы.

Доставка, основанная на клетках

В торая стратегия предполагает использование живых клеток для доставки терапевтических трансгенов в организм. В этом методе клетками доставки часто являются стволовые клетки, лимфоциты, фибробласты, они удаляются из организма, и терапевтический трансген, вводимый в них через те же транспортные средства, используемые в ранее описанном прямом методе передачи. В лаборатории генетически модифицированные клетки испытываются и затем растут и размножаться и, наконец, вводятся обратно в организм пациента (рис.7.2)

Генная терапия с использованием генетически модифицированных клеток предлагает несколько уникальных преимуществ по сравнению с прямым переносом гена в организм и надклеточной терапией, которая включает введение клеток, генетически немодифицированных. Во-первых, добавление терапевтического трансгена в клетки доставки происходит вне пациента, что позволяет ученым иметь высокую степень контроля, поскольку они могут выбирать и работать только с теми клетками, которые содержат трансген и производят терапевтический агент в достаточном количестве. Во-вторых, исследователи могут методом генной инженерии, или «программы», регулировать в клетках уровень и темпы производства терапевтического агента. Клетки могут быть запрограммированы, чтобы устойчиво в большом количестве производить терапевтический продукт. В некоторых случаях желательно программировать клетки, чтобы сделать большее количество терапевтического агента, и вероятность того, что достаточное количество, которое секретируется, достигнет пораженной ткани у пациента будет более высока. В других случаях желательно программировать клетки производить терапевтический агент в регулируемой форме. В этом случае терапевтический трансген будет активен только в ответ на определенные сигналы , такие как препараты для пациента , чтобы включить терапевтический трансген и выключить.

Исследователи могут использовать один из нескольких подходов для коррекции дефектных генов:

 -нормальный ген может быть вставлен в неспецифическое месте в геноме и заменить нефункциональный ген. Этот подход является наиболее распространенным.

 -аномальный ген может быть выгружен для нормального гена через гомологичные рекомбинации.

 -аномальный ген может быть исправлен с помощью селективной обратной мутации, которая возвращает ген в нормальное функционирование.

 -регулирование (включение или выключение) определенного гена могут быть изменены .

ВЕКТОРЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

В большинстве исследований генной терапии, "нормальный" ген вставляется в геном и заменяет "ненормальный", болезнетворный ген. Молекула-носитель называется вектор и должна быть использован для доставки терапевтического гена в клетки-мишени пациента. В настоящее время наиболее общим вектором является вирус, который был генетически изменен, чтобы нести нормальную ДНК человека . Вирусы развили способ инкапсуляции и доставки генов с клетками человека в патогенной форме. Ученые попытались воспользоваться этой возможностью и манипулировать геном вируса, чтобы удалить болезнетворные гены и вставить терапевтические. Клетки-мишени, такие как в печени или легких, заражаются вирусным вектором. Вектор затем выгружает свой генетический материал, содержащий терапевтический ген человека, в клетки-мишени.Генерирование функционального белкового продукта из терапевтического гена восстанавливает клетки-мишени в нормальное состояние (рис. 7.3) .

Н екоторые из различных типов вирусов используются в качестве векторов в генной терапии (рис. 7.4) :

 -Ретровирусы:класс вирусов , которые могут создать двунитевые копии ДНК их РНК геномов. Эти копии своего генома могут быть интегрированы в хромосомы клеток-хозяев. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является ретровирусом .

 -Аденовирусы:класс вирусов с двухцепочечной ДНК геномов, которые вызывают дыхательные, пищеварительные и глазные инфекций у людей. Вирус, который вызывает простуду, является аденовирусом .

 -Аденоассоциированные вирусы: класс мелких, двухцепочечных ДНК вирусов , которые могут вставить свой ​​генетический материал в определенное место хромосомы .

 -Вирусы простого герпеса: класс двухцепочечных ДНК вирусов , которые заражают определенный тип клеток, нейроны. Вирус простого герпеса 1 типа является общим человеческим патогеном , вызывающим герпес .

Невирусные методы

Невирусные методы представляют определенные преимущества перед вирусными методами, с простым крупномасштабным производством и низкой иммуногенностью хозяина. Ранее низкие уровни трансфекции и экспрессии гена , ставившие невирусные методы в невыгодное положение , однако , последние достижения в векторной технологии дали молекулы и методы с эффективной трансфекцией , аналогичной вирусам.

• Обнаженная ДНК: это самый простой метод невирусной трансфекции. Клинические испытания , проведенные при внутримышечной инъекции обнаженной ДНК плазмиды пршли с некоторым успехом , однако выраженность была очень низкой по сравнению с другими методами трансфекции. В дополнение к испытаниями с плазмидами , были испытания с невооруженным ПЦР-продукта , который имел аналогичный или больший успех . Этот успех , однако, не сравнить другими методами, что приводит к исследованию более эффективных методов доставки обнаженной ДНК , таких как электропорация и использование пистолета , который стреляет частицами покрытых золотом ДНК в клетку с помощью высокого давление газа .

• Олигонуклеотиды : Использование синтетических олигонуклеотидов в генной терапии заключается в инактивации генов, участвующих в процессе болезни . Есть несколько методов, с помощью которых оно осуществляется . Одна из стратегий использует антигенспецифический к гену-мишени , чтобы сорвать транскрипцию дефектного гена . Другой использует небольшие молекулы РНК , называемые sirРНК , чтобы сигнализировать клетки расщеплять определенные уникальные последовательности в мРНК транскрипта дефектного гена , нарушая перевод неисправного мРНК и, следовательно, экспрессии гена . Дальнейшая стратегия использует двунитевые олигодезоксинуклеотиды в качестве приманки для транскрипционных факторов , которые необходимы для активации транскрипции гена-мишени . Транскрипционные факторы связываются с приманкой вместо промотора дефектного гена , который уменьшает транскрипцию гена-мишени , снижая экспрессию . Кроме того, одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК были использованы , чтобы направить одно изменение базы с мутантным геном . Олигонуклеотид предназначен для отжига с комплементарности к гену-мишени , за исключением центральной базы , целевой базы, который служит в качестве шаблона базы для ремонта. Этот метод называют олигонуклеотид- опосредованной генной репарацией, направленной генной репарацией , или целевым нуклеотидным изменением.

• Липоплекс и полиплекс: для улучшения поставки нового ДНК в клетку , ДНК должны быть защищены от повреждений и его поступление в клетку должны быть облегчено .

С этой целью были созданы новые молекулы , липоплекс и полиплекс, которые обладают способностью защищать ДНК от нежелательной деградации в процессе трансфекции . Плазмидная ДНК может быть покрыта липидами организованной структуры , такими как мицеллы или липосомы . Когда организованная структура образует комплекс с ДНК его называют липоплекс . Есть три типа липиды, анионные ( отрицательно заряженные ) , нейтральный или катионный ( положительно заряженные ) . Первоначально, анионные и нейтральные липиды были использованы для построения из липоплексов синтетических векторов. Тем не менее, несмотря на токсичность, связанную с ними , они совместимы с жидкостями организма и существует возможность адаптации , чтобы они были тканеспецифичны ; они сложны и отнимает много времени , чтобы произвести таким образом, внимание было обращено в катионные версии. Наиболее распространенное использование липоплекса был в переносе генов в раковые клетки , где поставляемые гены активировали гены контроля супрессоров в клетке и снижали активность онкогенов . Недавние исследования показали, что липоплекс может быть полезным в трансфекции эпителиальных клеток дыхательных путей , так что они могут быть использованы для лечения генетических заболеваний дыхательных путей , таких как муковисцидоз. Комплексы полимеров с ДНК называются полиплекс. Большинство полиплекс состоят из катионных полимеров и их производство регулируется ионными взаимодействиями . Разницей между методами действия полиплекс и липоплекс является то, что полиплекс не может освободить свою нагрузку ДНК в цитоплазму , так и с этой целью со- трансфекции эндосомолитических агентов ( лизировать эндосомы , что делается во время эндоцитоза , процесс, при котором полиплекс проникает в клетку ), такие как инактивированная аденовирусов должно произойти . Тем не менее, это не всегда так, полимеры, такие как полиэтиленимин имеют свой собственный способ разрушения эндосом , как это делает хитозан и три - хитозан .

Терапевтический ДНК также может попасть внутрь клетки-мишени путем химического связывания ДНК с молекулой, которая будет связываться с особыми рецепторами клеток . После связывания с этими рецепторами , терапевтические конструкции ДНК проходит внутрь клетки-мишени. Эта система доставки менее эффективна, чем другие варианты.

ОГРАНИЧЕНИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

• короткометражный характер генной терапии: Перед генной терапией стоит задача постоянного лечения в любых условиях , терапевтический ДНК, введенный в клетки-мишени, должны оставаться функциональными и клетки , содержащие терапевтический ДНК должны быть долгоживущими и стабильными. Проблемы с интеграцией терапевтической ДНК в геном и быстро делящиеся характер многих клеток не позволяют генной терапии достичь каких-либо долгосрочных выгод . Пациенты должны будут пройти несколько раундов генной терапии.

• Иммунный ответ : В любое время иммунная система может атаковать чужеродный материал, введенный в организм человека. Риск стимуляции иммунной системы таким образом снижает эффективность генной терапии. Кроме того, усиливается реакция иммунной системы на захватчиков , которых она встречала и раньше, это осложняет повторные генные терапии у пациентов .

• Проблемы с вирусными векторами : Вирусы, как методы выбора в большинстве исследований генной терапии , представляют целый ряд потенциальных проблем для пациента - токсичность, иммунные и воспалительные реакции, а также контроля гена и ориентация в вопросе. Кроме того, всегда существует опасность того, что вирусный вектор , как только окажется внутри пациента, может восстановить свою способность вызывать заболевание.

• мультигенные расстройства: Условия или нарушения , которые возникают в результате мутаций в одном гене являются лучшими кандидатами для генной терапии . К сожалению, некоторые из наиболее часто встречающихся заболеваний, таких как болезни сердца, высокое кровяное давление, болезнь Альцгеймера , артрит и диабет , обусловлены совокупным воздействием изменений во многих генах .Мультигенные или многофакторные заболевания, такие как эти, будут представлять трудности для эффективного лечения с помощью генной терапии .

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

И нтригующая биология стволовых клеток и их подавляющая клиническая потенциальность представляет интерес для генной терапии .Стволовые клетки костного мозга, в том числе плюрипотентные гемопоэтические стволовые клетоки (ГСК ), мезенхимальные стволовые клетоки (МСК ) и, возможно мультипотентные прикрепленные клетки -предшественники ( MAPCs ) , в настоящее время рассматриваются в качестве потенциальных мишеней для клеточной и генной терапии в отношении различных различные заболевания (рис. 7.5 ).

Костный мозг (КМ ) часто используется в качестве поставщика стволовых клеток для подходов генной терапии . КМ состоит из как неадгезированных и адгезированных стволовых клеток. И ГСК и МСК могут самообновляться путем распространения и поддерживания фенотипа стволовых клеток. ГСК дают начало дифференцировке различных клеток крови , таких как миелоидных и лимфоидных клеточных линий , а МСК дают начало стромальным клеткам , принадлежащих к остеогенной , хондрогенной , адипогенной , миогенной и фибробластогенной линиям. Более примитивный приверженец стволовых клеток недавно был идентифицирован . Это мультипотентные клетки взрослых предшественников ( MAPC ) которые могут дифференцироваться в МСК эндотелия , в эпителиальные и даже гемопоэтические клетки . КM стволовые клетки , в том числе плюрипотентные ГСК и МСК и, возможно, примитивных MAPCs : рассматриваются в качестве потенциальных мишеней в подходах клеточной и генной терапии против множества различных заболеваний. Хотя использование стволовых клеток не может преодолеть полезность традиционных лекарственных средств , стратегии генной терапии с использованием стволовых клеток в сочетании с имеющимися лекарственными схемами может помочь в лечении неизлечимых болезней .

С появлением исследований генной терапии , гемопоэтические стволовые клетки , были клетками выбора доставки по нескольким причинам.

• Во-первых, хотя и небольшие по численности, они легко выводятся из организма через циркулирующую кровь костного мозга взрослых или пуповинную кровь новорожденных .

• Кроме того, их легко идентифицировать и манипулировать в лаборатории и легко можно возвратить в пациента с помощью инъекций.

• Способность гемопоэтических стволовых клеток давать начало многим различным типам клеток крови означает, что после того, как модифицированные стволовые клетки дифференцируются , терапевтический трансген будет находиться в клетках, таких как Т-и В -лимфоциты , естественных клетках-киллерах , моноцитах , макрофагах , гранулоцитах , эозинофилах , базофилах и мегакариоцитах .

• Клиническое применение гемопоэтических клеток в терапии гена стволовых клеток разнообразно и распространяется на трансплантацию органов, заболевания крови, костного мозга и иммунной системы .

• Кроме того, гемопоэтические стволовые клетки могут мигрировать в различные места в первую очередь в костный мозг, потом в печень, селезенку, лимфатические узлы. Это могут быть стратегические места для локализованной доставки терапевтических агентов при расстройствах , не связанные с кровеносной системой , такие как заболевания печени и нарушения обмена веществ( болезнь Гоше).

Генетически модифицированные МСК могут иметь прямое воздействие на заболевания у различных типов клеток в сложной микросреде и в различных тканях . Возможность генетически модифицировать МСК обеспечивает средство для прочной экспрессии терапевтических генов для жизни пациента для широкого круга заболеваний. МСК могут быть спроектированы на секрецию различных белков в пробирке и в естественных условиях , которые потенциально могут лечить различные сывороточные недостатки белка и другие генетические или приобретенные заболеваний , в том числе болезни костей, хрящей, КM и даже рака.