Эксперимент Дж.Ледерберг и э.Ледерберг, доказывающий мутационную природу изменчивости бактерий
1952- Дж.Ледерберг и Эстер Ледерберг разработали непрямой отбор мутантов методом реплик или отпечатков.
Осущ. при помощи стерильных кусочков бархата с коротким, жестким и густым ворсом. Бархат помещают на столик для реплик (деревянный или металлический) и закрепляют металлическим кольцом, чтобы поверхность была без морщин. Чашки Петри с выросшими колониями микроорганизмов накладывают поверхность среды на бархат и слегка прижимают. Чашку осторожно снимают. Ткань с отпечатками колоний может служить исходным штампом для засева методом реплик других чашек со средой.
Опыт Ледербергов:
Чистую культуру фагочувствительных E.coli в бульоне без фага, до концентрации 108 кл/мл. Высевали на поверхность среды в чашке Петри для образования сплошного роста. Методом реплик пересевают бактерии на 2 чашки – одна с обычной средой, другая предварительно засеянная фагом. Помещали в термостат. На чашке с фагом формировались отдельные фагоустойчивые бактерии. Затем чашки 1 и 2 совмещали и из чашки с обычным агаром в питательный бульон пересевали клетки из участка, соответствующего колонии фагоустойчивых бактерий. Снова засевали в чашку, переносили методом реплик на 2 чашки (с фагом и без).
Такую процедуру повторяли несколько раз пока не получили суспензию фагоустойчивых мутантов, никогда не имевших контакта с фагом.
Примечание к рисунку: каждый раз из бульона на чашку засевались бактерии с уменьшающейся концентрацией.
Этот эксперимент доказывает мутационную природу изменчивости бактерий
(2, с 172)
Эксперименты о.Эйвери и соавт. И значение полученных ими результатов
В 1944 г. Освальд Эйвери и сотрудники МакЛеод и МакКарти идентифицировали трансформирующий элемент как ДНК. Это был 1-й экспериментальный факт, доказывающий генетическую роль ДНК.
В эксперименте по трансформации использовали различные фракции клеток (белок, полисахариды, ДНК, РНК) и ими пытались осуществить трансформацию.
Только ДНК трансформировали клетки.(1, с 60)
В 1946 г. Эйвери и МакКарти обработали ДНК высокоочищенной ДНКазой и трипсином.
Трипсин не снижал трансформирующую активность
ДНКаза – снижает вплоть до прекращения.(1)
Методика опыта Эйвери:
Капсульные клетки пневмококков типа SIII, убитые нагреванием при 65 С, лизировали с помощью дезоксихолата натрия. Лизат осаждали спиртом. Полученный осадок растворяли и из него удаляли белок и полисахариды. После нескольких дополнительных переосаждений спиртом получали препарат ДНК, содержащий только 3% белка. Этим препаратом обрабатывали бескапс. клетки типа II (RII). Частота появления трансформантов была высокой. Получали клетки SIII.
Протеолитические ферменты и РНКаза на трансф. активность не влияли. ДНКаза снимала ее полностью
Значение их экспериментов: было доказано, что трансформирующим началом является ДНК. Значит, ДНК – это вещество наследственности
Позднее было показано, что использовании ДНК, меченой по фосфору (32P), метка необратимо встраивается в ДНК бактерии-реципиента. Между степенью включения метки и числом трансформантов существует прямая зависимость
(2 с 210)
Явление трансформации открыл Ф.Гриффит в 1928 на Diplococcus pneumoniae (=Streptococcus), который вызывал у мышей общее заражение крови. Из крови получали чистую культуру возбудителя.
Вирулентность пневмококка связана с наличием капсулы. Было известно, что можно получить бескапсульные формы.
Капсульные формы на агаре формируют влажные слизистые, блестящие колонии. S-форма (smooth).
Бескапсульные – сухие, шероховатые, морщинистые колонии с неровным краем. R-форма (rough)
Эксперимент Гриффита – см конспект с 60
В 1930 г. Даусон воспроизвел эксп. Гриффита с пневмококками других типов (1)
Установил, что выдерживание суспензии клеток в течение 2 суток при 37 С уничтожает трансформирующую активность такого препарата(2)
1931 г. Даусон и Сиа осуществили трансформацию признака капсулообразования путем выращивания клеток R-формы на твердой среде, куда были добавлены убитые клетки S-формы (1)
А также в жидкой питательной среде с добавлением крови (2)
1932,33 Элоуэй использовал бесклеточные экстракты S-клеток, трансформировал R-клетки в капсульные формы (1)
Пневмококки были разрушены замораживанием-оттаиванием или дезоксихолатом натрия, и лизат несколько раз переосаждали спиртом. Полученный осадок растворяли и смешивали с бескапсульными живыми клетками. Получали с высокой частотой капсульные клетки. (2)
Таким образом, работы 1928-1933 годов доказали существование трансформации у пневмококков. Явление может происходить как в организме животного, так и in vitro. Для трансформации необходим какой-то фактор, который не инактивируется при обработке лизата клеток спиртом. (2)