1 Общие сведения

1.1 Приготовление бактерийных препаратов для микроскопирования.

Для обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале и изучения их тинкториально-морфологических свойств, необходимо приготовить препараты, окрасить их и изучить под микроскопом.

Препараты для микроскопирования готовят на предметных стеклах. Материалом служат взвеси бактериальных культур, выросших на питательных средах, молоко, гной. Из таких материалов готовят препараты-мазки. Из тканей различных органов – препараты-отпечатки.

Предметные стекла, используемые при этом, должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Стекла хранят в банках с притертыми пробками в смеси из равных частей этилового спирта и эфира или в 96,6% спирте ректификате. Возможно, обезжиривание предметных стекол кусочком мыла.

Нанесение микробной взвеси на стекло производят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой. Бактериологические петли готовят из платиновых или нихромовых нитей в виде замкнутой петли, диаметром 2-3 мм. Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:

• Обезжиривание предметного стекла.

• Приготовление мазка.

• Высушивание препарата.

• Фиксация мазка.

• Окраска мазка.

В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.

Обезжиривание предметного стекла. Стекла, не бывшие в употреблении, сначала моют в воде, затем выдерживают в смеси спирта-эфира, фламбируют над пламенем горелки – это и есть обезжиривание. Новые стекла можно готовить путем кипячения 10 мин. в 1% растворе натрия гидрокарбоната (соды), промывания в дистиллированной воде с добавлением 0,5% соляной кислоты с целью нейтрализации и окончательного споласкивания в дистиллированной воде.

Приготовление мазка. Для приготовления мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло наносят бактериологической петлей небольшую каплю стерильного физиологического раствора.

Затем петлю прокаливают докрасна (стерилизуют фламбированием), внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего из пробирки с культурой вынимают пробку захватывая ее мизинцем и ладонью правой руки (рисунок 4).

Пробирку с культурой следует держать левой рукой, пробкой к себе. Вынув пробку, края пробирки обжигают и вносят в нее бактериологическую петлю. Прежде чем захватить небольшое количество культуры, петлю охлаждают, касаясь стенок пробирки. Петлю с культурой осторожно вынимают, еще раз обжигают края пробирки, а культуру вносят в приготовленную ранее каплю физраствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого овала или круга (1,5-2 см в диаметре). По окончании приготовления мазка петлю вновь прокаливают.

Рисунок 4 Схема приготовления препарата-мазка

Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло петлей 1-2 раза наносят исследуемый материал и равномерно распределяют.

Приготовленный препарат высушивают на воздухе, просохший мазок фиксируют.

Пастеровскими пипетками делают мазки из жидкостей и бульонных культур. Пипетка должна быть стерильной. Над пламенем горелки отламывают запаянный конец и набирают материал. После нанесения капли культуры на предметное стекло и ее распределения пипетку отпускают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Мазок высушивают при комнатной температуре.

Фиксация мазка. Фиксацию мазка проводят физическим и химическим способами.

Физический способ фиксации – над пламенем горелки. Для этого предметное стекло с мазком берут большим и указательным пальцами или пинцетом и проводят 3-4 раза над пламенем горелки, каждый раз, прикладывая стекло к коже руки. Ощущение жжения свидетельствует о том, что мазок фиксирован. При этом бактерии погибают, плотно прикрепляясь к стеклу. Этот способ нельзя применять при исследовании клетки.

Химический способ используют для фиксации мазков из крови и мазков-отпечатков, так как при действии высоких температур разрушаются клеточные элементы. Для этого препараты погружают в фиксирующую жидкость: в метиловый спирт - на 5 минут, в этиловый спирт - на 10минут, ацетон - 5 минут, смесь Никифорова (равный объем спирта и эфира) - на 15 минут.

Цель фиксации:

1) Закрепить бактерий на стекле.

2) Умертвить микробные клетки, обезопасив себе работу.

3) Коагулировать белок клетки, после чего она лучше воспринимает краситель.

Окраска мазка. В микробиологической практике для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:

Синие – метиловый синий, водный синий, опаловый синий; -красные – фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые – метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые – хризоилин, везувин.

При простом методе окраски применяют только один краситель. Раствором краски покрывают охлажденный фиксированный мазок, выдерживают 2-5 минут, краску сливают, мазок промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией. Этот способ окраски позволяет обнаружить в материале микроорганизмы и дать некоторые представления об их морфологии.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

Сложные методы окраски: по Граму и Цилю-Нильсену (кислотоустойчивых микроорганизмов).

Цель занятия. Приготовить, окрасить сложным методом и зарисовать препараты из микробных культур. Отработать методику сложного метода окраски приготовленных препаратов.

Материалы и оборудование. Рабочие растворы красок, спирт ректификат 96%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы, сливные чашки, мостики, карандаши или чернила по стеклу, песочные или другие часы, горелки (спиртовки), спички, кедровое масло, окрашенные препараты стрептококка и диплококка, таблица - морфология микробов.

Пробирки с взвесями бактерий (сальмонелл, стафилококков, эшерихий, вакцинного штамма сибирской язвы, атипичных микобактерий), спирт, раствор Люголя, генцианвиолет, фуксин Циля, 5% раствор серной кислоты, синька Леффлера, микробиологические петли, сливные чашки с мостиками, вода в колбах для смыва красителей с мазков, карандаши или чернила по стеклу, горелки, (спиртовки), микроскопы, иммерсионное (кедровое) масло, таблицы методов окраски.