1 Общие сведения

1.1 Методы стерилизации. Стерилизация (лат.sterilis - бесплодный) – обеспложивание; уничтожение в каком-либо материале патогенных и непатогенных микроорганизмов в вегетативной и споровой формах. Для стерилизации используют физические и химические методы. Механизмы их действия неодинаковы, но при выборе любого из методов должны быть соблюдены два основных требования: достижение полного обеспложивания и сохранение физико-химических свойств стерилизуемого материала.

1.2 Физические методы стерилизации. Методы заключаются в уничтожении микроорганизмов с помощью физических средств. К ним относят: стерилизацию сухим жаром, влажным жаром, фильтрованием, ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком.

Стерилизация сухим жаром включает в себя фламбирование и действие высокой температуры в виде сухого нагретого воздуха.

Фламбирование (прокаливание). Этим методом стерилизуют обычно металлические предметы: бактериологические петли, пинцеты и др.

Стерилизация сухим нагретым воздухом. Метод применяют для стерилизации чистой стеклянной посуды. Для этого используют печь Пастера – специальный сушильный шкаф с двойными стенками. Снаружи он облицован теплонепроницаемым материалом. В его верхней части находится термометр. Между теплонепроницаемой обшивкой и внутренним металлическим корпусом на дне помещен автоматический электронагревательный элемент. При включении электрошкафа в электросеть воздух внутри в него нагревается. По достижении заданной температуры отмечают время начала стерилизации. Режим стерилизации: при температуре 155-160°С – экспозиция 2ч, при 165-170°С –1-1,5ч, при 180°С – 1ч. по истечении времени стерилизации нагревание прекращают, и лишь когда температура снизится примерно до 45°С, шкаф открывают.

Нельзя стерилизовать сухим жаром воспламеняющиеся вещества, питательные среды, резиновые предметы.

Стерилизация влажным паром также включает в себя ряд методов.

Кипячение. Общепринятый метод стерилизации металлических инструментов (шприцев, игл, пинцетов, ножниц, скальпелей и др.), некоторых резиновых и стеклянных предметов, которые складывают в стерилизаторы – специальные металлические ванночки с крышкой и вставной решеткой – подставкой. Эту подставку выстилают двумя-тремя слоями марли или тонким слоем гигроскопической ваты. Шприцы стерилизуют в разобранном виде, в иглы вставляют мандрены. Режущие инструменты – лезвия скальпелей, ножниц обертывают марлей или ватой. В стерилизатор наливают воду (лучше стерилизованную) так, чтобы она полностью покрывала инструменты, и добавляют 2%-й раствор гидрокарбоната натрия. Стерилизатор закрывают крышкой. Кипятят 20-30 мин. После стерилизации воду осторожно сливают, а инструменты используют только после их охлаждения. Дистиллированную воду или приготовленный физраствор стерилизуют на небольшом огне в колбе.

Стерилизация текучим паром. Для стерилизации используют текучепаровой аппарат Коха – одностенный металлический котел цилиндрической формы с двойным дном и крышкой с отверстиями для термометра и выхода пара. На дно аппарата наливают воду до уровня, о котором судят по показанию водомерной трубки. Началом стерилизации считают момент закипания воды. Образующийся пар устремляется вверх непрерывной струей, соприкасаясь с обрабатываемым материалом.

Стерилизуют при 100°С 30-40 мин три дня подряд. Дробную стерилизацию при 100°С можно проводить в автоклаве, закрытом негерметично, при тех же режимах.

Однократное прогревание убивает только вегетативные формы микроорганизмов. Оставшиеся жизнеспособными споры в периоды между стерилизацией прорастают в вегетативные формы. Стерилизация на следующий день вызывает их гибель. На третий день прогревание гарантирует полное обеспложивание материала. Эффективность дробной стерилизации зависит от прорастания спор, а поэтому в промежутках между нагреванием материалы выдерживают при комнатной температуре (оптимум 25°С).

Тиндализация. Это дробная стерилизация при температурах ниже 100°С, которую проводят в водяной бане. Кратность прогрева зависит от температуры: при 70-80°С – 3 дня, 60-65°С – 5 дней, 56-58°С – 6-7 дней. В первый день материалы стерилизуют 2ч, в последующие дни – 1ч. в промежутках между прогреваниями стерилизуемый материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор. Коллоидные растворы, сыворотку крови, а также белоксодержащие вещества стерилизуют тиндализацией при 56-58°С, так как они разрушаются при более высокой температуре.

Этим методом стерилизуют питательные среды и другие материалы и вещества (желатина, углеводы), которые разрушаются при нагревании их свыше 100°С. Способ дробной стерилизации при температурных режимах не выше 100°С был разработан Тиндалем (1877).

Автоклавирование. Это стерилизация паром под давлением в сочетании с высокой температурой в специальном аппарате – автоклаве.

Вертикальный автоклав – это двустенный металлический котел цилиндрической формы, закрываемый герметично крышкой. Между стенками через специальный кран с воронкой заливают воду до определенного уровня. Внутренняя стенка котла в верхней части снабжена отверстиями, в нижней части котла – краном, через который при нагревании воды пар вытесняет воздух из котла. Сверху на автоклав надевают металлический защитный каркас, причем между ним и самим автоклавом должно быть свободное пространство. Автоклав нагревают включением в электросеть.

Автоклав загружают стерилизуемым материалом, закрывают крышку и кран, через который заливали воду, нижний кран временно оставляют открытым. Нагреваемая вода между стенками автоклава кипит, образующийся пар поднимается вверх и через верхние отверстия внутренней стенки проходит внутрь котла, толчками вытесняя воздух через нижний открытый кран. Когда воздух весь вытеснен и пар начинает выходить ровной струей, нижний кран закрывают. В результате давление пара внутри автоклава повышается. Началом стерилизации считают момент, когда давление достигает заданной величины (судят по показаниям манометра). Нагрев регулируют на протяжении всей стерилизации, поддерживая давление пара на одном уровне. При чрезмерном повышении давления внутри автоклава предусмотрен предохранительный клапан, через который избыток пара автоматический выходит наружу.

При повышении давления пара соответственно повышается и температура в автоклаве: 0,505х105 Па (0,5 атм) – температура 110-112°С;

1,01х105 Па (1 атм) – 120-121°С;

1,515х105 Па (1,5 атм) – 124-126°С;

2,02х105 Па (2 атм) – 132-133°С.

Манометр показывает давление пара без учета окружающего атмосферного давления (760 мм рт. Ст.). По истечении времени стерилизации автоклава отключают. После отсасывании при нулевом показании манометра открывают кран для спуска пара. Крышку открывают осторожно на себя, не заглядывая в котел, оберегая лицо и глаза от возможного остаточного пара. До полного выхода пара открывать крышку нельзя, так как при быстром падения давления внутри автоклава стерилизуемые жидкие среды закипают и выталкивают из пробирок пробки вместе с жидкостью.

Автоклавированием стерилизуют питательные среды, выдерживающие нагревание выше 100°С (МПА, МПБ), а также физиологический раствор, стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал и спецодежду, сложенные в металлические бюксы; обеззараживают использованные бактериальные культуры.

Пастеризация. Этот метод предложил Луи Пастер для сохранения питательной ценности пищевых продуктов (молоко, мясные, рыбные и овощные консервы), которая снижается при кипячении (разрушаются витамины и некоторые другие вещества). При пастеризации продукт нагревают до 80°С 30 мин, затем резко охлаждают (до 4-8°С). Крупные предприятия (молокозаводы) оснащены специальными пастеризаторами с охладительной системой. Пастеризация снижает количество бактерии: погибают вегетативные формы, а споры сохраняются. Резкое охлаждение и последующее хранение при низкой температуре (4-5°С) препятствуют прорастанию спор и последующему размножению бактерий.

Существует три режима пастеризации: длительная – при температуре 63-65°С в течение 20-30 минут, кратковременная – при 75°С от нескольких секунд до 5 минут, моментальная – при 90-93°С без выдержки.

Стерилизация фильтрованием – метод, с помощью которого обычно стерилизуют жидкости, не выдерживающие нагревания (сыворотки крови, растворы антибиотиков и др.). Жидкости пропускают через бактериологические фильтры. Фильтрование происходит за счет перепада давления, вызванного либо приложением повышенного давления к жидкости, находящейся над фильтром, либо созданием вакуума в приемнике фильтра. Действие фильтра состоит в механической задержке и адсорбции микроорганизмов стенками пор фильтра. Однако следует помнить, что размеры бывают меньше среднего диаметра пор фильтров.

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами – метод, применяемый для обеззараживания воздуха в помещении (боксах, операционных). В лаборатории источником УФ-лучей обычно служат специальные бактерицидные лампы. Бактерицидные лампы также нашли применение в пищевой промышленности при хранении различных продуктов (температура выше 0°С).

Стерилизация ультразвуком – метод, который используют для обеззараживания воды, молока, некоторых продуктов, а также кожевенного сырья. Стерилизующее действие ультразвука связано с возникновением в цитоплазме бактерий кавитационных пузырьков, заполненных парами под давлением около 10 тыс. атм., вследствие чего разрушаются внутренние структуры бактериальной клетки.

1.3 Химические методы стерилизации. Сводятся в лабораторной практике к консервированию питательных сред, вакцин, а также лечебных и диагностических сывороток различными химическими соединениями (соли металлов, щелочи, антибиотики и др.) с целью предупреждения бактериального загрязнения. Питательные среды консервируют хлороформом, толуолом, иногда эфиром (для освобождения от консерванта среду нагревают до 56°С). Вакцины и лечебные сыворотки консервируют 0,25-0,5%-м раствором фенола, 0,5%-м раствором хлороформа,. 0,5%-м раствором формалина или раствором мертиолата (в конечном разведении 1:5000 –1:10000). Для консервирования агглютинирующих сывороток используют борную кислоту, толуол, глицерин.

1.4 Биологические методы стерилизации. Применяются в вирусологии для стерилизации живых культур клеток. Стерилизацию проводят с помощью антибиотиков: пенициллин, стрептомицин, нистатин и т.д.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6

Питательные среды. Приготовление питательных сред.

Цель занятия. Освоить основные методики приготовления искусственных питательных сред, наиболее широко применяемых в лабораториях. Изучить способы посевов и пересевов микроорганизмов на питательные среды. Произвести посев культур микробов на МПБ и МПА (в пробирки), а также посев смеси микробных культур (для выделения чистых) методом рассева на чашки Петри с МПА.

Оборудование и материалы. Компоненты для приготовления питательных сред: агар-агар, желатина, пептон, х.ч. NaCl, колбы с мясной водой, раствор 8-10%-ный KOH, воронки, гигроскопическая вата, марля,

фильтровальная бумага, градуированные пипетки различной емкости, дистиллированная вода, стерильные пробирки с ватными пробками, компаратор, электроплитки. Готовые сухие среды.