69.Природа люминисценции. Устройство и принцип работы люминисцентного микроскопа.

Люминесцентная микроскопия — один из высокочувстви­тельных и весьма перспективных современных методов исследо­вания. Он позволяет обнаруживать даже небольшие концентрации вирусов в исследуемом материале. В люминесцентном микроскопе видны многие микроструктуры, неразличимые в обычном свето­вом микроскопе, благодаря их природной флуоресценции или об­работке особыми красителями — флуорохромами. Это такие ве­щества, которые обладают интенсивной флуоресценцией. Они широко используются в люминесцентной микроскопии для обра­ботки биологических объектов, имеющих слабую собственную флуоресценцию.

Люминесценция (флуоресценция) — это свечение веществ под воздействием различных видов энергии, возникающее в ре­зультате преобразования энергии, поглощенной данным вещест­вом. Молекулы, поглощающие кванты внешней энергии, прихо­дят в возбужденное состояние, вследствие чего их электроны переходят на орбиты более высоких энергетических уровней. При возвращении на прежние орбиты они отдают избыток энергии в виде квантов света — фотонов. Непрерывный поток фотонов, из­лучаемых возбужденным веществом, и есть люминесценция. В современных люминесцентных микроскопах используют чаще всего сине-фиолетовые лучи, получаемые с помощью специальных фильтров. После возбуждения люминесцен­ции они поглощаются желтым светофильтром, который укрепля­ется на окуляре. В результате создается темный фон в поле зрения микроскопа.

В настоящее время в лабораториях используют люминес­центные микроскопы В любом из них можно выделить три основные части: собственно микроскоп, осветительное устройство и источ­ник света. Осветительное устройство состоит из кварцево­го коллектора, полевой и апертурной диафрагм, регулирующих поток света и камеры со светофильтрами, последние применят для выделения из светового потока сине-фиолетовых лучей. Виру­сологические препараты изучают в падающих сине-фиолетовых лучах. Они проходят через окуляр и падают на препарат. Источником света в люминесцентных микроскопах служат ртутно-кварцевые лампы, обладающие большой поверхностной яркостью. .

Микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вредные газы от источника света.

В вирусологической практике люминесцентную микроско­пию используют в двух основных методах: флуорохромировании и методе флуоресцирующих антител.

Флуорохромирование — это обработка препарата одним или несколькими флуорохромами с целью увеличения силы и контра­стности свечения. Метод флуорохромирования может быть ис­пользован для: 1) обнаружения крупных вирусов; 2) выявления внутриклеточных включений; 3) излучения ЦПД вируса в куль­туре клеток; 4) определения типа нуклеиновой кислоты вируса.

Метод флуорохромирования не сложен, но он не дает возможности идентифицировать возбудителей заболеваний.

70. Титрование вирусов по инфекционному действию. При работе с вирусами постоянно возникает необходимость определения его количества в том или ином материале. Без этого невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство вакцин и диагностических препаратов, оценка активности противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и др.

Титр вируса — это количество вирусных частиц в единице объема материала. Однако, количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых единицах (объем, масса), поэтом прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности (инфекционные единицы). В практике нашли применение два типа единиц количества вируса: 1) инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемые вирусами и оцениваемые по единичному эффекту; 2) инфекционные единиц 50%-го действия вирусов на чувствительные живые объекты.

Определение титра вируса по инфекционным единицам локальных повреждений. Из локальных повреждений, вызываемы вирусами, известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины — некротические узелки на ХАО куриных эмбрионов. В этих случаях говорят о бляшкообразующих единицах (БОЕ) и оспинообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной образовать одну бляшку, а одна ООЕ — одну оспину.

Определение титра по инфекционным единицам 50%-го действия вирусов на чувствительные живые объекты. Наиболее универсальным является метод определения титра вируса в единицах 50%-го инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимают такую его дозу, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных объектов. Она обозначается как ЭД₅₀— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вирусов в единице объема материала и есть его титр в данном материале.

Но, в зависимости от вида объекта и характера его поражения, название эффективной дозы может изменяться. Если виру вызывает гибель зараженных лабораторных животных, титр обозначают символом ЛД₅₀ (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Если же вирус вызывает только определенные признаки болезни, титр обозначают ИД₅₀ (инфекционная доза для 50% зараженных животных). При титровании в куриных эмбрионах и гибели их титр обозначают как ЭЛД₅₀ (эмбриональная летальная доза); при учете лишь патологоанатомических изменений в курином эмбрионе — ЭИД₅₀ (эмбрион-инфицирующая доза); в случае проявления ЦПД в культуре клеток — ТЦД₅₀ (тканевая цитопатическая доза).

Титр вируса выражают в количестве инфекционных доз приходящихся на единицу объема. Например, 10^3.48 ТЦД_50/0.2мл; 10^4.5 ЕИД_50/0.2мл; 10^7.45 ЛД_50/0.2 мл.

Титрование вирусов по 50%-му инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный практически для любого вируса, если подобрать к нему живую систему (тест-объект). Однако, этот метод довольно трудоемкий, длительный и требую статистических расчетов.