• керекті антигенді синтездейтін гендерді клондау;

• клондалған гендерді векторға кіргізу (вирустерге, плазмидаларға);

• векторларды продуцент-жасұшаларға (вирустер, бактериялар, саңырауқұлақтар) кіргізу;

• In vitro жасұшаларды культивирлеу;

• антигенді бөліп алып оны тазалау немесе вакцина ретінде продуцент-жасұшалармен қолдану.

ДНҚ-вакциналар инактивирленген вакциналардың қауыпсыздығымен және тірі вакциналардың күшімен сипатталады.

Сары сулар (Serum) ағзада пассивті иммунитет қалыптастырады, ол 2-3 жұма сақталады. Осы қасиетті ауру ағзаларды емдеуге және ауру қоздырылу қауыптығы бар жерлерде алдын алу шаралармен қолданады. Иммунды сары суларды жануарларды иммундеп немесе жануарлар-реконвалесценттерден (инфекциялық аурулармен ауырған жануарлар) алады.

Сары суларды биофабрикаларда және биокомбинаттарда жылқылардан, бұқалардан, қойлардан, шошқалардан, есектерден, қашырлардан екі кезеңді гипериммунизация өткізіп алады.

Бірінші кезеңде жануарлар-продуценттерге 1-2 рет вакцина кіргізеді.

Екінші кезеңде мөлшерін көтеріп ұзақ уақытта микроағзалардың штаммдарының вирулентті дақылын кіргізеді.

Иммунизация аяқталғаннан кейін продуценттердің қанын алып , сары су дайындайды.

Антитоксикалы сары суларды алғанда жануарлар-продуценттерді алдымен анатоксинмен иммундеп, кейіннен токсин кіргізеді.

Негізінде иммунды сары суларды зертханалық немесе табиғи сезімталды жануарларда антигенмен гипериммунизация өткізіп алады. Мысалы, нейроинфекция қоздыратын вирустерге қарсы қолданатын сары суларды алғанда ең жарамды жануар – теңіз шошқасы. Осы жануарлардың қарын жақтарына 1:100 көлемін арттырып белсенді вирустің суспензиясын 4-6 жұма мерзімінде әр бір 4-5 күнде еңгізіп отырады.

Белсенді вирусті еңгізбей отырып алдын ала формалинденген суспензияның екі инъекциясын салады. Теңіз шошқалардың миына құрамында вирусы бар суспензияны екі қатар кіргізгенде антиденелердің титрі тез және деңгейі өте жоғары болып көтеріледі. Және тағы да теңіз шошқаларды белсенді вирусті материалмен келесі кесте бойынша иммундеуге болады: 1) қарын ішіне инъекция; 2) 10 күннен кейін тері астына инъекция; 3) 10 күннен кейін ми ішіне инъекция. Материалдың ақырғы инъекциясынан 10 күн өткеннен кейін жануарлардың қанын толығынан алады. Осы кестемен еңгізілетін вируске теңіз шошқалар сезімталды болмаса қолданады.

Құрамында антиденелердің деңгейі жоғары тұмауға қарсы сары суларды ақ тышқандардың тұмсықтарына 2 мл вирусті суспензияны еңгізіп алады. Осы бағытта теңіз шошқаларды да иммундеп қолдануға болады. Антигендерді еңгізу кестесі әр түрлі болады. Мысалы, қарынның ішіне инфицияланған тауықтардың эмбриондарының аллантоистық суйықтығын кіргізуге болады. Суйықтықты 3-7 күн аралықта 2 мл 6 рет немесе 3 күн қатарынан салып төртінші күнде тағы бір қайталайды.

Вирустік диареяға қарсы ерекше сары суды салмағы 2,5-3 кг шиншилла үй қояндарының немесе 2-4 жасар ешкілердің көмегімен тазаланған вируспен қолданып алады.

Иттердің оба вирусіне қарсы антиденелері бар сары суларды келесі кесте бойынша алуға болады:

• ит-продуценттердің қандарының сары суларын инфекциялық гепатиттің және парвовирустік энтериттің ВН-антиденелерінің болмауын бақылау;

• иттердің 2-3 айлық күшіктерін иттердің обасына қарсы культуралды вакцинамен иммундеу;

• иттердің күшіктерін үш қатар, аралығы 7 күннен 1 кг тірі салмағына 1, 2 және 4 мл мөлшерлерде құрамында иттердің оба вирусі бар материалмен гипериммундеу;

• алынған сары суды серологиялық белсенділікке бақылау

• жануарлар-продуценттерден тоталды қан алу және қанның сары сулы фракциясын бөліп алу;

• алынған препараттарды лиофилиздеп немесе қатырып консервілеу.

Ірі қара малдың оба вирусіне қарсы сары суды бұзаулардың және шошқалардың көмегімен келесі кесте бойынша алады:

• жануарларға ірі қара малдың оба ауруына қарсы К3770 штаммының вакцинасымен вакцинация өткізу;

• вакцинациядан кейін 14-21 тәүлік өткізіп инъекция араларында 7 тәүлік аралығын сақтап үш қайтарып ірі қара мал обасынан өлген бұзаулардың лимфа бездерінің және көк бауырларының 20 пайыздық суспензиясымен гипериммунизация;

• сары суларды белсенділікке және ерекшелікке бақылау, жануарлардың қанын алу және сары суды консервілеу немесе лиофилиздеу.

Сары суларды лиофилиздеген жағдайда рефрижераторда 4 жыл сақтауға болады немесе лиофилиздемей қатырып 1 жыл сақтайды. Осы жағдайларда олардың антиденелерінің титрі төмендемейді.

Бақылау сұрақтары:

1. Вакциналардың қандай түрлері бар?

2. Әр түрлі вациналардың алу әдістемелері.

3. Сары суларда алғанда өткізетін жұмыстар.

ТАҚЫРЫП 7. Иммуноглобулиндерді шығарып алу

Сабақ мақсаты. Диагностикалы сары суларды алуға арналған жануарлардың қасиеттері. Иммуноглобулиндер тұралы түсініктеме, оларды пайдалану мақсатымен, алу әдістемесімен танысу. Дайын сары сулардың зерттеу технологиясымен танысу.

Сарамандық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес келетін фабрикада және қолдан жасалған плакаттар.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:

1. Сарысуларды алуға арналған жануарлардың сипаттамаларымен танысу.

2. Иммуноглобулиндерді алу әдістемелерімен танысып жұмыс ретін анықтау.

3. Алынған сарысуларды белсенділікке, қауыпсыздыққа, зарарсыздандырылған жағдайына қарастыру.

Сары суларды алуға арналған жануарлардың дені сау болу керек. Оларды инфекциялық аурулардан таза жерлерден алады. Жұмыс бастар алдында мал дәрігерлер жануарларды зерттейді.

Биофабрикаға түсер алдында жануарларды карантинде ұстайды. Зерттеу аяқталғаннан кейін, жануарлардың иммунизациясын бастайды. Иммунизация ұзақ уақыт өткізіледі және иммунделген жануардың ағзасында антиденелер жиналу мақсатымен бір неше рет өткізіледі. Иммунизацияны белгіленген микробтың өлтірілген дақылдарымен бастайды, кейіннен күші азайған және вирулентті микробтармен өткізеді.

№1 кесте

Жылқыларды гипериммундеп тілмеге қарсы сары су алу кестесі

Инъекциялар	Дақылдың көлемі, мл	Инъекциялар	Дақылдың көлемі, мл
1-ші	50	7-ші	280
2-ші (6 күн өткеннен кейін)	100	8-ші	300
3-ші	150	9-шы	350
4-ші	180	10-шы	400
5-ші	200	11-ші	400
6-ші	250	12-ші	400
		13-ші	400

Алты күн өткеннен кейін қан тамырына 14-ші 50 мл инъекция еңгізіледі, тағы 6 күн өткеннен кейін тері астына 100 мл 15-ші инъекция еңгізіледі және тағы 6 күн өткеннен кейін тері астына 16-шы 200 мл еңгізеді.

Ақырғы инъекциядан 12 күн өткеннен сон қанды алып оны белсенділікке тексереді (антиденелердің жаратылысын бақылайды).

Иммунизацияны аяқтап, сары суды белсенділікке тексеріп болғаннан кейін, иммунделген жануарлардан қан алады. Әр бір иммунделген жануардын тірі салмағының 50 кг 800 мл қан алады. Бір белгіленген уақыт осы жануарлар демалады, кейіннен тағы иммунизацияға жіберіледі.

Қанды мойын тамырынан алады, қан 1-3 литр шыны цилиндлерге жиналады, 3 сағат 37 градуста, кейіннен 8 градуста тұнып тұрады. Бөлініп шыққан сары суды сорып алып карбол қышқылымен консервілейді (сары суда 0,5 пайыз карбол қышқылы болу керек). Дайын сары суды ыдыстарға құяды.

Иммуноглобулиндер (гамма-глобулиндер). Емдеу мақсатымен қолданылатын иммуноглобулиндер – гамма- және бета-глобулиндері бар жануарлардың қанының сары суының глобулиндік фракциясының сулы ерітіндісі. Иммуноглобулиндерді гипериммундық сары сулардан дайындайды. Оларды емдеу және алдын алу мақсатымен қолданады.

Қәзіргі уақытта спецификалық емес нормальді глобулиндермен қолданады. Оларды дені сау жануарлардың қанының сары суынан алады, құрамында гамма- және бета-глобулиндердің кешені болады. Нормальді глобулин ағзаның табиғи резистентігін жоғарлатады, ағзаның өсуіне және дамуына әсер береді.

Қан тамырынан қанды алу, сары суды сорып ыдыстарға салу зарарсыздандырылған жағдайларда өткізілу керек. Иммунды сары сулардың сақтау мерзімдері әр түрлі болады; олардың сақталу мерзімдері, пайдалану мөлшерлері, сақтау жағдайлары және олармен қолдану әдістері нұсқауларда көрсетіледі.

Әр бір иммунды сары су биофабрикадан шығар алдында бақылаудан өтеді. Сары сулар тексеріледі: 1) белсенділікке, 2) зарарсыздану сапасына, 3) қауыпсыздыққа. Сары судың белсенділігі және қауыпсыздығы сынаудағы жануарлардың көмегімен зерттеледі. Зарарсыздандыру сапасын тексергенде сары суды анаэробтық және аэробтық жағдайларда қоректік орталарға себеді. Әр бір иммунды сары су белсенді, зарарсыздандырылған, қауыпсыз болу керек, басқаша айтқанда осы сары сулар арқылы жануарларда пассивті иммунитет жаратылу керек.

Зарарсыздандыру сапасын тексергенде зерттелетін сары су ыдыстардан пастер пипеткасымен алынып қоректік орталарға себіледі. Қоректік орталар 5 тәүлікке 37 градусқа термостатқа қойылады. Қоректік орталарда микробтардың өсүі байқалса, сары суларды брак деп есептейді.

Қауыпсыздыққа сары суларды теңіз шошқалардың және ақ тышқандардың көмегімен зерттейді.

Белсенділікті сынаудағы жануарлардың қабылдағышының көмегімен зерттейді. Мысалы, ірі қара малдың қарасан аурауына қарсы иммунды сары суды теңіз шошқаларда тексереді, шошқаның бациллярлық тілмесіне қарсы сары суды көгершіндерде немесе ақ тышқандарда тексереді.

Бақылау сұрақтары:

1. Иммунды сары суларды қалай алады?

2. Иммунды сары су алу кестесі.

3. Иммуноглобулиндер тұралы түсініктеме.

4. Иммунды сары суларды тексеру тәртібі.

ТАҚЫРЫП 8. Моноклоналды антиденелер (1 бөлім)

Сабақ мақсаты. Моноклоналды антиденелерді алу әдісімен танысу. Моноклоналды антиденелерді алғанда жұмыстарды ұйымдастыру тәртібімен танысу.

Сарамандық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес келетін фабрикада және қолдан жасалған плакаттар. Моноклоналды антиденелерді алғанда қолданатын құрал-жабдықтар.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Сабақта келесі сұрақтар қарастырылу керек:

1. Гибридомды технологиямен танысу. Әдістің ұстанымы.

2. Моноклондарды алу. Тышқандардан жасанды ісік – гибридомалар – алу.

3. Гибридомалардан және иммундық жасұшалардан гибридтық жасұшаларды алу.

4. Моноклоналды антиденелерді алғанда ұйымдастырылатын жұмыстар және қолданылатын құрал-жабдықтар.

5. Сынауға жануарларды таңдау.

Биологиялық құрылымдарды зерттегенде, осы құрылыммен өзгеше қарым-қатынасқа кіретін реагенттерді іздеу – зерттеулердің негізі. Осындай қасиет әмбебабты реагентте – иммуноглобулиннің молекуласында бар. Иммуноглобулиндер антидене болып тек қана антигендермен қарым-қатынасқа кіреді. Бірақ көп құрылымдарға жағдай тұдырса, олар антигенге айналып комплементарлы антиденелер жаратылуға жағдай тұдырады (мысалы, күшті иммуногендермен коньюгатталғанда). Сондықтан биологияның және медицинаның әр түрлі бөлімдерінде негізінде антиденелермен қолдану жатқан иммунологиялық әдістер кең таралған.

Әдістің тарихы. Зерттеушілердің мақсаты – өзгешелігі жоғары антиденелерді алу әдістерін табу. Бір белгілі жағдайда бактериалды полисахаридтермен иммунизация өткізсе – өзгешелігі жоғары антиденелердің жоғарыгомогенді аппаратын алуға болады. Осыдан басқа, плазмацитоманың (антидене жарату жасушадан жаратылған ісік) иммунды жануардың көк бауырының жасұшаларымен қосылуы мүмкін. Осылай гибридтік жасұшалар (гибридомалар) алынады. Гибридомалар ісік жасұшалардан шексіз көбею мүмкіншілігін, ал көк бауырдың жасұшаларынан – белгілі өзгешелігі бар антиденелер синтездеу мүмкіншілігін алған.

Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу әдісіне келесі методологиялық жұмыстар жол берген:

1. Миеломалар алу, оларды ағзадан бөлек өсіру;

2. Жасұшалардың соматикалық гибридизация әдісі.

Вирустерге қарсы тұратын иммуноглобулиндер поликлоналды гетерогенді антиденелер болады. Неге десек – олар әр түрлі клондардың В-лимфоциттерінің қоспасы.

Антигеннің молекуласының белсенді топтарының (бір неше аминқышқылдар) кешеңіне қарсы иммунды жасұшаларда (гибридомаларда) бір белгілі иммуноглобулин (моноспецификалы антидене) синтезделеді. Иммундық жасұшалардың ісік жасұшалармен гибридизациясы жасанды ісік – гибридома жаратады. Оны алу техникасы гибридомды технологияға жатады. Гибридомаларды жасұшалардың бір клонымен (моноклоналды антиденелер (МКА)) секреттелетін гомогенді антиденелер шығарады.

Әдістің ұстанымы. Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасұшалардың қосылуынан кейін гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау.

Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті еңгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік тұды. Антигенді 3-5 рет 0,5-5 мг мөлшерде еңгізеді. Бірінші инъекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0,5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2-4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді.

Суспензияны 170 об/мин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп астында алынған суспензияның жасұшаларының өмірге кабілеттігін анықтайды. Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0,1 пайыздық ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында бір тәүлік бұрын 24-ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік жасұшаларды салады. Қоректік жасұшалар ретінде тышқандардың немесе теңіз шошқалардың макрофагтарын алады.

Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75 пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 10⁸ көк бауырдың жасұшаларын және 10⁷ миеломды жасұшаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 об/мин центифугадан өткізеді; тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0,5 мл 50 пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады; 10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин, амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді.

Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде ортаны ауыстырып отырады.

2 – 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасұшалары бар 96-ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында анықтайды. Дақылды суйықтықты жұма сайын радиоиммундық, иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан иммуноглобулиндерінің барын анықтайды.