Лабораторная работа 1. ''Определение содержания ''сырого протеина'' и определение истинного белка в дрожжах. Выделение белков из дрожжей''. План работы.

1. Экстрагировать свободные аминокислоты из дрожжей и хранить экстракт на холоду до 9 занятия (1.2.).

2. Экстрагировать белки из биомассы дрожжей (1.2.).

3. Построить калибровочную кривую для определения общего азота по методу Несслера.

4. Определить содержание азота в исходном белковом экстракте и рассчитать содержание белка в дрожжах (1.4.).

5. Определить содержание азота в биомассе дрожжей и рассчитать содержание ''сырого протеина'' (1.5.).

6. Белки части исходного экстракта осадить ацетоном и вместе с оставшимся экстрактом сохранить на холоду до 2 занятия (1.2.).

7. Определить влажность дрожжей (1.3.).

1. Выделение белков из биомассы микроорганизмов.

В дрожжевых и других микробных клетках содержатся тысячи различных типов белков, большинство из которых присутствуют в виде сложных комплексов и других соединений (липопротеиды, нуклеопротеиды, гликопротеиды, хромопротеиды и т.п.) и заключены в разного рода ультраструктурные элементы клеток. Дрожжевые клетки заключены в прочную клеточную оболочку полисахаридной природы, через которую белки не могут диффундировать. Выделение белка поэтому связано с разрушением оболочек дрожжевых клеток (дезинтеграция, обезжиривание, экстракция белков, переосаждение белков).

Гомогенизация и дезинтеграция.

Для гомогенизации и дезинтеграции клеток используют гомогенизаторы, ультразвук, проводят обработку СВЧ, пропускают через пресс и т.д. Но самым доступным способом разрушения клеток является растирание их в ступке с корундом, абразивом или окисью алюминия.

Обезжиривание.

Многие белки заключены в клеточные органеллы, окружённые биомембранами, являющиеся липопротеидами. Если предварительно не провести обезжиривание биомассы, при котором разрушаются биомембраны, то экстракция белка произойдёт неполно. Для наиболее полного извлечения белков необходима стадия обезжиривания дрожжей различными органическими растворителями. В качестве этих растворителей используют спиртоэфирные, хлороформенно-метанольные смеси или чистые неполярные растворители. При непрерывной экстракции используют аппарат Сокслета, при периодической – проводят нагревание с обратным холодильником.

Экстракция белков.

Большая часть микробных белков представлена альбуминами и глобулинами.

Альбумины – класс белков, хорошо растворимых в воде и слабых растворах нейтральных солей.

Глобулины растворяются только в слабых растворах нейтральных солей.

Почти все белки растворяются в щелочных растворах при нагревании, что используется при выделении общего белка.

При выделении же ферментов используются более мягкие методы экстракции буферными растворами при физиологических значениях рН и пониженной температуре с целью сохранения функции того или иного фермента.

1.2. Принцип выделения белков из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Исследуемый материал: дрожжи Saccharomyces cerevisiae прессованные (влажность около 70%) или любая микробная биомасса.

Реактивы:		Оборудование:
1. Этиловый спирт (80%);		1. весы технические;
2. эфир диэтиловый (серный, медицинский);		2. фарфоровая ступка с пестиком; 3. обратные холодильники;
3. раствор 15% NaCl с 0,3% Na2CO3;		4. водяная баня;
4. раствор 1н. NaOH;		5. центрифужные стаканы;
5. абразив или корунд.		6. центрифуга;
		7. стеклянные палочки;
		8. мерные цилиндры на 100 см3
		9. пипетки, колбы, воронки химические.

Техника проведения эксперимента. Навеску прессованных дрожжей 5 г. помещают в ступку, добавляют 80% этанола и растирают с 1 г. абразива в течение 10 мин. Полученную массу переносят в коническую колбу на 200 см³, используя для смыва со ступки ещё 30 см³ 80% этанола, затем экстрагируют на водяной бане (75-80⁰С) с обратным холодильником 20 мин., периодически перемешивая содержимое колбы.

После охлаждения содержимое колбы переносят в центрифужный стакан на 100 см³ и отделяют осадок центрифугированием при 4-5 тыс. об/мин. в течение 5 мин.

Центрифугат, содержащий свободные аминокислоты, часть липидов и другие соединения, сливают в чистую колбу и оставляют в холодильнике до занятия по изучению свободных аминокислот. Осадок используют дальше для полного удаления липидов из биомассы. Для этого к осадку в центрифужном стакане приливают 50 см³ смеси спирта и эфира (1:1), тщательно перемешивают стеклянной палочкой и через 15-20 мин. центрифугируют при 4-6 тыс. об/мин. в течение 5 мин. Подсушенный на воздухе осадок представляет собой обезжиренные разрушенные клетки.

Белок экстрагируют затем 1н. NaOH в колбе с обратным холодильником. Экстракцию проводят на водяной бане при температуре 90⁰С в течение 30 мин.

После экстракции содержимое колбы переносят в центрифужный стакан. Центрифугирование проводят при 4-5 тыс. об/мин. в течение 5 мин. Супернатант сливают в мерный цилиндр, осадок ещё раз промывают 30 см³ NaOH, тщательно перемешивают и снова центрифугируют. Объединяют два супернатанта, измеряют общий объём жидкости, содержащий экстрагированный из биомассы дрожжевой белок. Осадок выбрасывается.

В дрожжах и белковом экстракте необходимо провести биохимические исследования, определить их белковый и аминокислотный состав для оценки их качества.