Тема 15 санитарно-микробиологическое исследование воды

Цель занятия:

1.Ознакомить студентов с санитарно-бактериологическими методами исследования воды, молока, кормов.

2.Оценить санитарное и практическое значение этих исследований.

Материалы и оборудование: Чашки Петри с МПА, набор пробирок со средой Кода, Кесслера, стерильный физраствор; демонстрация бродильного (титрационного) метода в среде Кода, колонии воздушной микрофлоры в чашках Петри; пробы стерильные градуированные пипетки; аппарат Кротова, фильтр Зейтца, мембранные фильтры, счетная камера.

Методические указания:

Санитарно-микробиологическое исследование воды

Воду исследуют по следующим показателям:

1. ОМЧ в 1 см³ воды.

2. Определение ОКБ, ТКБ или титра кишечной палочки (коли-титра, коли-индекса).

3. Обнаружение патогенных микробов.

4. Определение коли-фагов.

Исследованию подвергают водопроводную воду, воду открытых водоемов, артезианских колодцев, бассейнов, бутилированную воду, а также сточные воды до и после очистки. Исследование воды каждой из этих категорий приводят, руководствуясь соответствующими норманивными документами. При отборе проб из водопровода кран стерилизуют обжиганием с последующим спуском воды в течение 1-10 мин при полностью открытом кране.

Пробы воды из открытых водоемов берут с помощью специальных приборов (батометров), которые опускают на определенную глубину. После забора воды прибор поднимают на поверхность. Пробы воды отправляют в лабораторию немедленно. Она должна быть исследована не позднее 2 ч после отбора или 6 ч при хранении ее при температуре 1-5°С.

Определение ОМЧ в воде.

Из исследуемой пробы воды отбирают 2 см³. 1 см³ выливают в пустую стерильную чашку Петри и 1 см³ - в пробирку с 9 см³ стерильной дистиллированной воды (1:10). Этой же пипеткой набирают 2 см³ воды в разведении 1:10, 1 см³ выливают во вторую стерильную чашку и 1 см³ — во вторую пробирку с 9 см³ стерильной дистиллированной воды (1:100). Из разведения 1:100 1 см³ воды выливают в третью стерильную чашку. В каждую из трех чашек выливают по 10-12 см³ расплавленного и охлажденного до 45°С МПА, вращательными движениями перемешивают агар с водой. После застывания среды чашки ставят в термостат вверх дном при температуре 37°С на 24 часа. Затем приступают к подсчету колоний, выросших на поверхности и в глубине агара. Подсчет колоний проводится с помощью лупы или специального прибора. Чашку вверх дном кладут на черный лист бумаги, каждую подсчитанную колонию отмечают со стороны дна чашки карандашом или чернилами для стекла. Оценивают только те разведения, при посеве которых на среде в чашках Петри вырастает от 30 до 300 колоний. Если большое количество колоний трудно подсчитать, то с помощью пластинки с сеткой подсчитывают колонии в разных местах чашки, в 20 квадратах площадью 1 см² выводят среднее арифметическое в одном квадрате и умножают на площадь чашки в сантиметрах. Чтобы результаты выразить количеством микробов в 1 см³ воды, число выросших колоний умножают на степень разведения воды и вычисляют среднее арифметическое количество колоний, подсчитанных в двух чашках.

Пример: в одной чашке при посеве воды в разведении 1:10 выросло 53 колонии, в другой чашке при посеве этой же воды в разведении 1:100 выросло 6 колоний. Следовательно, в 1 см³ воды содержится: 53х10 + 6х100 / 2 = 565 микробных клеток. Округляем до 560. Таким образом, в данном случае ОМЧ воды – 560 КОЕ.

Питьевая вода считается водой хорошего качества, если общее количество бактерий (ОМЧ) в 1 см³ – не более 100 КОЕ (колониеобразующих единиц); сомнительной (не соответствующей ГОСТу) – свыше 50-100 КОЕ. Если в 1 см³ воды содержится более 500 КОЕ бактерий, она непригодна для питья.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий.

При исследованиях воды очень важно обнаружить такой санитарно-показательный микроорганизм, как кишечная палочка и сходные с ней бактерии. Их называют бактериями группы кишечной палочки (БГКП) или колиформными микроорганизмами. Кишечная палочка – показатель свежего фекального загрязнения воды. Остальные микроорганизмы этой группы – показатели относительно давнего фекального загрязнения воды. При санитарно-микробиологических исследованиях бактерии группы кишечной палочки именуют общими колиформными бактериями – ОКБ.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) - грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты и газа при температуре (37+1)°С в течение 24-48 часов.

Конкретно вид Escherichia coli при санитарно-микробиологических исследованиях именуют термотолерантными колиформными бактериями – ТКБ.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при температуре (44+0,5)°С в течение 24 часов.

ОКБ - основной нормируемый показатель при оценке качества воды водоемов в местах водозаборов для централизованного водоснабжения, рекреации, в черте населенных пунктов. ОКБ - наиболее чувствительный показатель при выявлении источников фекального загрязнения, в том числе небольших.

ТКБ - рекомендуется определять одновременно в одном и том же посеве с ОКБ для подтверждения фекального происхождения загрязнения.

ОКБ и ТКБ должны отсутствовать в 100 см³ воды централизованного и децентрализованного водоснабжения.

Иногда, например, при исследовании воды поверхностных водоёмов, присутствие бактерий группы кишечной палочки в воде определяют в виде коли-титра и коли-индекса воды.

Коли-титр воды - это наименьший объем воды (мл), в котором обнаруживается 1 кишечная палочка.

Коли-индекс - количество кишечных палочек в 1 л воды.

Установив коли-титр, можно произвести пересчет на коли-индекс. В отличие от других микроорганизмов, кишечная палочка может размножаться при температуре до 45°С, легко сбраживать углеводы с образованием кислоты и газа. Это свойство микроба положено в основу определения коли-титра.

Существует несколько методов определения ОКБ, ТКБ и коли-титра.

Метод мембранных фильтров. Сущность этого метода заключается в концентрировании микробов из определенного объема воды на мембранных фильтрах с последующим выращиванием их на фильтрах на среде Эндо и дифференцированием выросших колоний.

Мембранные фильтры № 3 кипятят в дистиллированной воде, кладут на асбестовый фильтр Зейтца и фильтруют через него определенное соответствующей методикой количество воды (например, питьевой воды - 333 см³, воду открытых источников - в нескольких объемах: 100 см³, 10 см³, 1 см³, 0,1 см³). После окончания фильтрации фильтр захватывают стерильным пинцетом и кладут на поверхность среды Эндо в чашках Петри. Инкубируют в термостате 18-24 ч. При обнаружении на фильтре колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском или без него), готовят мазки, окрашивают по Граму, ставят оксидазную пробу. Оксидазной пробой дифференцируют кишечную палочку от других грамотрицательных водных сапрофитов, которые в отличие от кишечной палочки обладают ферментом оксидазой (например, Pseudomonas sp.)

Подсчитывают лактозоположительные оксидазоотрицательные колонии грамотрицательных микробов, что характерно для кишечной палочки, и вычисляют коли-индекс.

Пример: профильтровано три объема воды по 100 см³. На первом фильтре выросло 3 колонии кишечной палочки, на втором - 5 колоний, на третьем - 4 колонии. Среднее арифметическое (3+5+4) : 3=4 колонии при посеве 100 мл воды, соответственно в 1000 мл - 40 кишечных палочек. Значит коли-индекс равен 40, коли-титр равен 25 (1000 : 40).

Бродильный метод. Сущность этого метода заключается в посеве определенных объемов воды в дифференциально-диагностические среды. При наличии изменений сред, характерных для роста кишечной палочки, пересевают культуру на среду Эндо и проводят ее идентификацию.

В зависимости от водоисточника, проводят посев различных объемов воды. Например, при исследовании воды открытых водоемов – 100 см³, 10 см³, 1 см³, 0,1 см³. Объемы 100 см³ и 10 см³ высевают в колбы или флаконы, 1 см³ и 0,1 см³ — в пробирки.

Для исследования воды бродильным методом используют дифференциально-диагностические среды Кода (с лактозой и индикатором бромтимоловым синим), Хейфеца (с маннитом, розоловой кислотой и метиленовым синим), Кесслера (с лактозой и генцианом фиолетовым), Булира (с маннитом и нейтральным красным с поплавком). Посевы воды культивируют в термостате при 37°С или при 44°С в течение суток. Из пробирок и флаконов, в которых отмечено помутнение среды, образование кислоты или газа при расщеплении углевода, производят пересев на среду Эндо бактериологической петлей густым штрихом для получения изолированных колоний. При обнаружении темно-красных колоний с металлическим блеском или без него проводят микроскопию с окраской по Граму и дальнейшую идентификацию кишечной палочки по общепринятой методике.

Результат анализа выражают в виде коли-индекса, который определяют по специальным таблицам. Так, например, при отсутствии роста кишечной палочки во всех объемах воды (100 см³, 10 см³, 1 см³, 0,1 см³) коли-индекс будет менее 9, коли-титр — более 111.

По ГОСТу коли-титр водопроводной воды в городах должен быть не менее 300 (коли-индекс не более 3), в многомиллионных городах коли-титр не менее 500 (коли-индекс не более 2). Вода открытых водоемов считается хорошей при коли-титре 100, коли-индексе 10.

В настоящее время наряду с определением коли-титра в воде проводят также определение титра Enterococcus faecalis. Для этого цельную воду и ее разведения в объеме 1 см³ засевают в одну из жидких элективных сред для энтерококков (щелочно-полимиксиновая энтерококковая среда и др.), а затем проводят идентификацию данных микроорганизмов.

В качестве СПМО воды используют также бактериофаги кишечной палочки – коли-фаги, а также фаги сальмонелл и шигелл. Их обнаруживают там, где есть соответствующие бактерии, к которым эти фаги адаптированы. Фаги выживают во внешней среде более 9 мес. Они ценны как показатель фекального загрязнения, особенно энтеровирусами, так как фаги выделяются из сточных вод с той же частотой, что и энтеровирусы (например, возбудитель гепатита А человека). По устойчивости к хлору фаги сравнимы с энтеровирусами, поэтому их считают одним из показателей качества очистки сточных вод.

Коли-фаги – бактериальные вирусы, способные лизировать E.coli и формировать при температуре 37⁰С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки, негативные колонии) на питательном агаре.

Метод определения коли-фагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении их в среде обогащения на культуре E.coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона E.coli на питательном агаре. Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.