Коринебактерии, бактероиды, микобактерии

Цель занятия:

1. Ознакомить студентов с основными биологическими свойствами микроорганизмов групп коринебактерии и микобактерии.

2. Изучить морфологию коринебактерий и микобактерий, особенности культивуироования

3. Ознакомить студентов со схемой исследования материала на наличие микобактерий – возбудителей туберкулёза.

Материалы и оборудование: Набор готовых красок во флаконах в штативе, йодированный спирт, раствор Люголя, дистиллированная вода, предметные стекла, фильтровальная бумага, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными культурами в штативе. Микроскопы. Пробирки и чашки Петри с характерным ростом изучаемых микроорганизмов на питательных средах.

Методические указания:

Коринебактерии в определителе Берджи относятся к отделу Firmicutes, группе 20 «Грамположительные, не образующие спор палочки неправильной фор-мы». Филогенетически они близки к актиномицетам и родственным им организмам в теме «Микроорганизмы почвы»)

Группа разнообразна. Большинство представителей группы - грамположительные палочки неправильной формы, растущие в присутствии воздуха и не образующие эндоспор, но есть в группе бактерии, имеющие форму кокков или палочек правильной формы, окрашивающиеся отрицательно по Граму и являющиеся строгими анаэробами.

Род Corynebacterium - коринебактерии (дифтероиды)

К роду Corynebacterium (греч. согупе - булава) относятся палочковидные формы, склонные к морфологической изменчивости с образованием булавовидных, слабоветвящихся клеток, часто располагающихся под углом ввиде букв V, Y. Помимо плеоморфизма для представителей этого рода характерно «защелкивание» клеток при их делении. Оно происходит из-за того, что соединяющая дочерние клетки перегородка расслаивается на разных сторонах с разной скоростью, так что клетки внезапно оказываются под углом друг к другу. Большинство коринебактерий - неподвижные грамположительные, некислото-устойчивые, хемоорганогетеротрофы, энергию получают за счет процессов дыхания или брожения, преимущественно облигатные аэробы, но есть и факультативные анаэробы. Большинство коринебактерий - облигатные обитатели кожных покровов и слизистых оболочек человека и животных, а также почвы, воды, воздуха. Ряд видов является возбудителями болезней растений, человека и животных.

Непатогенные виды коринебактерий - дифтероиды - используются в промышленности для производства аминокислот - нуклеотидов, ферментов, биоконверсии стероидов и производстве сыров. Одним из наиболее изученных видов коринебактерий Сorynebacterium glutamicum применяется при биосинтезе глютаминовой кислоты.

Corynebacterium diphtheriae - обитатель дыхательных путей, может вызывать заболевание дифтерию. В физиологическом отношении эта бактерия - нетипичный представитель группы: она живёт в микроаэрофибных и анаэробных условиях, тогда как большинство коринебактерий - аэробы. Corynebacterium diphtheriae содержит зёрна метахроматина, расположенные в концах клетки, при специальном методе окраски по Нейссеру видна в виде палочек с булавовидными расширениями на концах. Дифтерийная палочка поражает полость зева и миндалины человека, вызывает дифтеритическое воспаление с образованием плотных плёнок (больной человек может задохнуться); образует сильно действующий экзотоксин, который может вызывать паралич мягкого нёба, конечностей и сердечной мышцы - «постдифтерийный паралич». Большинство штаммов непатогенны, но приобретают способность к образованию токсинов после заражения фагом.

Род Бактероиды (лат. bacteroides) – род грамотрицательных анаэроб-ных бактерий, наиболее типичные нормальные обитатели кишечника  человека, составляющие около половины всей его микрофлоры. Бактероиды полиморфны, часто имеют форму палочки с закругленными концами размером 1–3 на 0,5–0,8 мкм. Бактероиды не образуют спор, но могут образовывать капсулы.  В связи с трудностью анаэробного культивирования и, следовательно, с высокой стоимостью исследования бактероиды при анализах во многих лабораториях не определяются. Бактероиды — антагонисты шигелл. Сальмонелл некоторых видов  эшерихий.

По современной классификации род бактероиды входит в семейство  Bacteroidaceae, порядокBacteroidales, класс Bacteroidia, тип Bacteroidetes, царство Бактерии.   Различные штаммы бактероидов появляются у человека спустя 10 дней после рождения Основное место обитания бактероидов в человеческом организме — толстая кишка. В 1 грамме высушенных фекалий здоровых людей обнаруживается  10¹⁰–10¹² клеток бактероидов. Бактероиды также входят в состав нормальной микрофлоры женских половых органов, верхних дыхательных путей, полости рта и гортани. В норме у взрослого человека в полости рта в титре содержится не более 10³ КОЕ/г бактероидов. Бактероиды часто находятся в полостных органах человека, связанных с внешней средой, но они отсутствуют у здоровых людей в стерильных внутренних органах и брюшной полости. Присутствуя в организме человека бактероиды могут вызывать различные гнойно-воспалительные заболевания после травм, оперативных вмешательств, инструментальных исследований, при онкопатологиях или иммунодефиците, такие как перитонит, абсцессы, эндокардит, сепсис, тонзиллит, пародонтоз и другие.

Род Mycobacterium - Микобактерии

Микобактерии относятся к отделу Firmicutes Группе 21 определителя Берджи; объединены в семейство Mycobacteriaceae с одним родом Mycobacterium. Микобактерии - это грамположительные. аэробные, неподвижные палочки, прямые или неправильных очертаний. В процессе развития палочковидные формы превращаются в кокковидные. Характерным морфологическим признаком микобактерий является образование ветвящихся форм. Но ветвление можно наблюдать только в молодых, активно размножающихся культурах. Многие микобактерии синтезируют желтые или оранжевые каротиноидные пигменты.

На некоторых стадиях роста для микобактерий характерна повышенная устойчивость к кислотам и спиртам - «кислотоустойчивость», которая обусловлена высоким содержанием в клеточных стенках миколовых кислот, делающих поверхность микобактерий воскообразной и сильно гидрофобной. Поэтому колонии микобактерий имеют сухую, шероховатую, морщинистую поверхность, а в жидких культурах клетки слипаются с образованием плотной пленки.

Большинство микобактерий - сапротрофы, живущие в почве, в торфе, на растениях и использующие для питания различные органические соединения, очень устойчивые во внешней среде. Имеются микобактерии, постоянно живущие на слизистых оболочках и в полостях тела человека и животных. Это, например, Mycobacterium smegmatis, обитающая в моче и смегме - выделениях наружных половых органов человека и животных. Некоторые виды микобактерий патогенны, например, М. tuberculosis. М.bovis. М.avium - возбудители туберкулеза человека, крупного рогатого скота, птиц, М. paratuberculosis - возбудитель паратуберкулёза к.р.с., М. leprae - возбудитель проказы (лепры).

Лабораторная диагностика туберкулеза

Туберкулез - инфекционная, хронически протекающая болезнь человека и животных Патологоанатомически характеризуется образованием туберкул (бугорков) в органах и тканях и творожисто-перерожденных туберкулезных очагов. Болеют практически все виды животных и птиц, в т.ч. пресмыкающиеся. При аэрогенном заражении первичный инфекционный очаг развивается в легких, а при алиментарном - в мезентериальных лимфатических узлах, из первичных очагов микобактерии могут попасть в кровь, что приводит к генерализации процесса; факторы вирулентности туберкулёзных микобактерий - эндотоксины-туберкулины. Клинические признаки туберкулёза - истощение, слабость, кашель (или понос), субфебрильная температура, гибель.

• M.tuberculosis (человеческий тип) (палочка Коха)

• М. bovis (бычий тип),

• М. avium (птичий тип),

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД: Материал для исследования: молоко, моча, слизь, пораженные органы и ткани (лимфоузлы, плевра, отрезки кишечника и т.п.)/ Доставляют свежим, замороженным или после консервации 30-40% водным р-ром глицерина.

Микроскопия. Прямые или слегка изогнутые палочки 1,5 до 4 мкм. Гр+ , Сп-, К-, непод­вижны; кислото-спирто-щелочеустойчивые, часто располагаются скоплениями. При окраске по Цилю-Нильсону - красные на синем фоне.

Культивирование. Подготовка пат. материала перед посевом проводится химическим способом - это обработка 6-10% раствором серной кислоты (метод Гона, метод Аликаевой и т.д.). Для жидкого материала применяют метод флотации с NaOH и ксилолом.

Посев на специальные глицериновые яично-картофельные питательные среды с брилли­антовым зелёным: Петранъяни, Гельберга, Левенштейна-Иенсена, пересев на глицериновый бульон, глицериновый картофель. Микобактерии - строгие аэробы. Первые признаки роста возбудителя птичьего типа появляются на средах через 15-25 дней, человеческого типа - через 25-35 дней, бычьего типа - через 40-70 дней.

При культивировании приходится дифференцировать патогенные и непатогенные микобактерии. Имеется группа быстрорастущих непатогенных микобактерий (рост за 24-72 часа); группа непатогенных микобактерий, образующих на свету различные пигменты и др.

Культуральные свойства: при культивировании возбудителя туберкулёза на жидких питательных средах образуется рыхлая, матовая,морщинистая пленка. На плотных средах колонии в R-форме -«бородавчатые», сухие, цвета слоновой кости или сплошной сухой налёт.

Возбудитель может размножаться и образовывать микроколонии на стекле при нанесении пат.материала на предметное стекло, обработки его H2SO4 и после погружения в жидкую кровяную среду типа Школьниковой - это метод Прайса. После инкубации при 37°С' на 1-й - 15-й и 30-й день мазки вынимают из пробирки, высушивают, фиксируют, окрашивают по Цилю-Нильсену, микроскопируют. Выявляют микроколонии в виде «жгутов» или «кос».Это явление «корд-фактора», его образуют только патогенные микобактерии.

Биохимические свойства определяют только при углублённом изучении микобактерий.

БИОПРОБА. Определение вирулентности культуры проводят параллельно для морских свинок, кроликов и птиц. Лабораторных животных используют и для идентификации видов возбудителя

АЛЛЕРГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА: Детей до 18 лет ежегодно проверяют на туберкулёз постановкой реакции Манту. У животных подобное исследование называют туберкулинизацией. Для изготовления аллергенов-туберкулинов для млекопитающих используют штаммы вида Mycobacterium bovis. Применяют сухой очищенный туберкулин (протеин-пурифитед-дериват- ППД). Это сухой очищенный экстракт из туберкулёзных бактерий бычьего вида. Туберкулин инъецируют КРС, верблюдам, оленям в толщу кожи в области средней трети шеи, свиньям на наружной поверхности основания уха. курам в толщу кожи бородки. Людям - в кожу предплечья. Учитывают р-ю через 72 ч по результатам измерения толщины кожной складки. Положительная реакция проявляется в виде покраснения, припухания, у КРС кожная складка увеличивается на 3 мм и более. Положительно реагирующих животных выбраковывают на мясо.

БИОПРЕПАРАТЫ. В 1924 г. французские ученые Кальметт и Герен предложили вакцину против туберкулеза. Этот штамм назван культурой BCG (Bacterium Calmett - Guerin, 1924), по русски - БЦЖ. Вакцинируют людей. Биопрепараты для специфической профилактики и терапии у животных не разработаны.

СХЕМА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЁЗА, вызванного микобактериями M.tuberculosis (человеческий тип), М. bovis (бычий тип), М. avium (птичий тип)

Этапы иссле-дования	Патологический материал В зависимости от локализации очага поражения: мокрота, фекалии, соскобы кожи, молоко. моча; от погибших и убитых – лимфоузлы, лёгкое, отрезок кишечника, кость и т.д.
1	Мазок (мелкие тонкие палочки, Гр+Сп-, Капс.-неподвижные, кислото-спирто-щёлочеустойчивые Располагаются одиночно скоплениями, иногда «палисадом») По Цилю-Нильсену – красные на синем фоне	Предварительная подготовка погибшщих и убитыхпат.материала: 1.Обработка раствором серной кислоты по Аликаевой или Гону; 2.Обработка щёлочью или ксилолом методом флотации. Посев из «флотационного кольца»
2	Экспресс-метод выращивания микрокультур на стекле по Прайсу: мазок на узком стекле в кровяной среде - выявление Корд-фактора	Посев на специальные плотные картофельно-яично- глицериновые среды Петраньяни, Левенштейна-Иенсена, Гольберга или на специальные синтетические среды типа ФИНН-2
3	Изучение культурально-биохимических свойств: Длительное культивирование - до 2-3 месяцев. Аэробный рост. На специальных средах - матовые, шероховатые «бородавчатые» колонии цвета слоновой кости, в R-форме. На жидких глицериновых средах - сухая серая плёнка.
4	Дополнительное биохимическое тестирование для дифференциации от патогенных микобактерий
5	Биопроба одновременно па кроликах, морских свинках и курах (см.выше)

Практическая работа.

1. Из заранее приготовленного настоя торфа, сена, содержащего непатогенные кислотоустойчивые бактерии, приготовить мазки для микроскопии.

2. Мазки высушить, зафиксировать, окрасить по Цилю-Нильсену.

3. Микроскопировать мазки. Результаты зарисовать в рабочей тетради.

ТЕМА 5

Коллоквиум № 1 по теме: «Микробиоценозы организма животных и человека»