Задание 2 – Освоить методы стерилизации исходного растительного материала Пояснение к заданию:

Основу культивирования растительных клеток и тканей составляет содержащаяся в каждой клетке информация обо всех свойствах и возможностях организма и способность клетки к самостоятельному обмену веществ (Катаева, Бутенко, 1983). Для культивирования подходят различные органы растений. Как правило, используют молодые листья и осевые побеги верхних мутовок, а также столоны, клубни, пыльники, кончики корней, пазушные почки и другие части растения. Меристемные ткани верхушек ростовых побегов и корней имеют особое значение для получения безвирусных клонов.

Для размножения древесных часто используют вегетативную почку или точку роста побега. Использование почки имеет ряд преимуществ: почка представляет собой уже сформированный рудиментарный побег; почки древесных хорошо защищены чешуей, и потому из них легче получить стерильную культуру; почки сравнительно легко укореняются. Культуру почек используют для размножения многих древесных, в том числе, эвкалипта, кофе, сосны, вяза, яблони, смородины и многих других видов (Катаева, Аветисов, 1981).

Под исходным растительным материалом понимается любая часть растения, используемая для извлечения экспланта.

Для микроразмножения используют два основных типа исходного растительного материала: ювенильный (семена и их отдельные части, а также части проростков) и молодые ткани взрослых растений (почки, хвоя, ткани листа, побеги). Чаще используется ювенильный материал (Царев, Погиба, Тренин, 2001).

Все работы, проводимые с культурой ткани должны осуществляться в стерильных условиях, с использованием предварительно обработанных (простерилизованных) посуды и инструментов.

Для подготовки исходного растительного материала к извлечению экспланта чаще всего применяется поверхностная стерилизация. В.С. Шевелуха и др. (1995) отмечают, что поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, его обрабатывают антибиотиками. Особенно богаты внутренней инфекцией ткани тропических и субтропических растений с крупными сосудами.

Р.Г. Бутенко (1964), Г.П. Бутова (1987) и др. указывают на то, что при стерилизации исходного растительного материала необходимо учитывать основное правило выбора стерилизующего раствора – вещество должно обеспечивать наибольший процент неповрежденных тканей, способных к росту и новообразованию, при наименьшем проценте инфекции, а также баланс времени – чтобы, с одной стороны продолжительность воздействия не повредила бы клеткам растительной ткани, с другой – обеспечила уничтожение патогенных микроорганизмов.

Стерилизующие вещества, применяемые для обработки исходного растительного материала, делят на 3 группы:

1. Ртутьсодержащие – сулема (0,1-0,2%), диацид и др.

2. Хлорсодержащие – гипохлорид кальция, натрия (8-10%), хлорная известь, хлорамин (10-15%) и др.

3. Окислители – перекись водорода, перманганат калия (10-12%) и др.

Для приготовления раствора определенное количество стерилизатора взбалтывают в одном литре воды в течение 10 минут и отфильтровывают.

Перед стерилизацией растительные объекты должны быть тщательно подготовлены:

- очищены от остатков земли, засохших листьев и т.п.;

- обмыты теплой водой с использованием моющих средств (мелкие объекты - семена, почки и др. помещают в марлевые мешочки, затянутые ниткой);

- несколько раз промыты проточной водой;

- обмыты дистиллированной водой;

- побеги древесных растений нарезают на отрезки длиной 20-30 см, срезы парафинируют (чтобы стерилизатор не проник вовнутрь сосудистого цилиндра и не произошла интоксикация ткани);

- корнеплоды и клубни отбирают здоровые, неповрежденные вредителями так как ходы, сделанные личинками, могут стать источником инфекции.

Начинают стерилизацию с погружения растительного материала в 96% этиловый спирт (для удаления воскового налета и усиления действия стерилизующих средств). Продолжительность погружения составляет для корней, клубней, побегов – 2-3 мин., семян – 1 мин., почек – 30 сек., листьев – 10 сек. (Калашникова, Родин, 2001).

Стерилизация тканей проводится в течение от 1 до 30 мин. в зависимости от исходного материал и стерилизующего вещества.

Мясистые корни и клубни стерилизуют в хлорсодержащих растворах - хлорной извести в течение 20-25 мин или препаратах гипохлорита натрия – хлорокс и кальция – питхлор концентрацией 70 г/л - 5-10 минут.

Завязи, плоды и листья стерилизуют в окислителях - растворе перманганата калия или перекиси водорода в течение 10 минут.

Стебли травянистых, молодые побеги древесных растений стерилизуют погружением в перекись водорода или раствор хлорной извести на 5-10 минут.

Побеги древесных растений стерилизуют обжиганием в пламени - погружая в 96% спирт на 1-2 минуты, а затем обжигают в пламени горелки (операцию повторяют несколько раз) или в растворе сулемы в течение 45 минут (рисунок 2.2).

Мелкие объекты - стерилизуют раствором хлорной извести в течение 15 минут или раствором перекиси водорода (сухие семена растений 10-12 минут, набухшие – 6-8 минут). Если объект не тонет в стерилизующем растворе рекомендуется поместить сверху кусочек стерильной ваты (Бутенко, 1971; Котов, Лебедева, 1979).

Рисунок 2.2 – Стерилизация пламенем побега древесного растения

После стерилизации исходный растительный материал необходимо тщательно промыть дистиллированной водой, меняя ее 3-4 раза.

Загрязнение культур грибами или бактериями обычно выявляется через 1-14 дней после начала культивирования, такие культуры необходимо удалять, чтобы избежать заражения воздуха в лаборатории.

Порядок выполнения работы:

1. Освоить технику стерилизации культуральных инструментов;

2. Ознакомиться с правилами и техникой стерилизации исходного растительного материал;

3. Провести стерилизацию культурального инвентаря, исходного растительного материала (по заданию преподавателя).

Материалы и оборудование: культуральные сосуды и инструменты, исходный растительный материал (плоды, листья, побеги, семена древесных растений), этиловый спирт, 10%-ный раствор перекиси водорода, перманганат калия, дистиллированная вода, мыльная вода, марлевые мешочки, нитки, стерильная вата, парафин, спички, спиртовка, аптечка.

Вопросы для самопроверки:

1. Чем отличается систематическая инфекция, наблюдаемая в культуре тканей, от случайной? Что необходимо сделать для ее устранения?

2. Условия культивирования эксплантов?

3. Способы подготовки культурального оборудования и исходного растительного материала к стерилизации?

4. Каким образом проводят стерилизацию инструментов для вычленения и пересадки тканей? бюксов? пробкобуров?

5. Что лежит в основе культивирования растительных клеток?

6. Что такое исходный растительный материал? Какие части растений применяются при культуре тканей в качестве исходного растительного материала?

7. В каком случае при подготовке исходного растительного материала к извлечению экспланта достаточна лишь поверхностная стерилизация?

8. Необходимые условия и требования к выбору стерилизующего раствора при работе с исходным растительным материалом?

9. От чего зависят срок воздействия и выбор стерилизующего вещества при стерилизации исходного растительного материала? Приведите примеры.

10. Как проводят стерилизацию плодов, листьев, стеблей, семян древесных растений? Перечислить все этапы проводимой операции.