Занятие № 2

ВЫДЕЛЕНИЕ РНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА Р1АТОМ™ ЯМ РВЕР 100

Набор реагентов О1а1;от™ 1ША Ргер 100 применяют для выделения тотальной РНК из клеток как прокариот,так и эукариот. Очищенная РНК может быть использована в дальнейшем для проведения реакции обратной транскрипции.

Ход работы. 1. Содержимое флакона с концентратом солевого буфера полностью переносят в мерный цилиндр, доводят объем раствора до 50 мл дистиллированной водой, а затем до 300 мл 96%-ным этанолом и перемешивают. Хранить рабочий раствор солевого буфера следует в плотно закрытой емкости при температуре2-8 'С.

2. Вносят исследуемую пробу (образец свежей животной или растительной ткани) в микропробирку объемом 1,5 мл.

3. Добавляют в пробирку 400 мкл лизирующего реагента и перемешивают.

4. Инкубируют пробу в течение 20 мин в термостате при 65 °С.

5. Добавляют в пробирку 20 мкл суспензии сорбента. Перед использованием сорбент следует суспендировать на вортексе до исчезновения осадка! ?

6. Содержимое пробирки встряхивают на вортексе и выдерживают 7—10 мин, периодически перемешивая содержимое переворачиванием плотно закрытой пробирки 5—6 раз.

7. Добавляют в пробирку 800 мкл рабочего раствора солевого буфера, содержимое перемешивают, переворачивая пробирку 5—6 раз.

8. Центрифугируют 10—20 с при 5000 §. ■ ■/

9. Надосадочную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора или декантацией.

10. К осадку добавляют 1 мл рабочего раствора солевого буфера, содержимое пробирки встряхивают на вортексе до полного суспендирования осадка.

11. Центрифугируют 10—20 с при 5000 §.

12. Надосадочную жидкость удаляют при помощи автоматического дозатора или декантацией.

13.Повторяют операции, изложенные в пп. 10—12. Внимание! В последний раз надосадочную жидкость необходимо

удалить как можно более полно, не задевая при этом осадка.

14.Осадок сушат 5—7 мин при 65 "С.

15.К высушенному осадку добавляют 100 мкл ЭкстраГена Е™ и суспендируют содержимое пробирки на вортексе дважды по 5—10 с с интервалом в 15 мин до получения гомогенной суспензии.

Внимание! Перед использованием ЭкстраГен Е™ необходимо полностью суспендировать и отбирать при перемешивании.

16. Центрифугируют пробирку 1 мин при 10 000 #.

17. Надосадочную жидкость (раствор РНК) целиком переносят в чистую пробирку. Хранить полученный раствор РНК не рекомендуется, желательно сразу использовать для ОТ!

Контрольные вопросы. 1. Каковы основные этапы выделения и очистки нуклеиновых кислот при использовании методов сорбции? 2. Каково действие гуанидинтиоцианата? 3. С какой целью применяется солевой буфер? 4. Какова роль суспензии ионообменников?

Задания. 1. Получить препарат ДНК растительного происхождения. 2. Получить препарат РНК растительного происхождения.

Практическая работа № 5 выделение плазмидной днк из рекомбинантных бактериальных клеток

Бактерии, помимо хромосомной ДНК, несут один или более небольших генетических элементов — плазмид, которые реплицируются независимо от хромосомной ДНК и обладают радом специфических свойств, позволяющих использовать их в генетической инженерии. Плазмиды бактерий представляют собой двухцепочечные замкнутые кольцевые молекулы ДНК, размер которых варьирует от 1 до 200 тыс. п.н. (для сравнения — размер бактериальной хромосомы составляет около 3 млн п.н.).

Основное свойство плазмид — их способность к автономной репликации. При этом некоторые плазмиды (например, р11С, рСЕМ) реплицируются с образованием большого числа копий. Данный процесс осуществляется при наличии в плазмиде одного или нескольких сайтов начала репликации — оп-сайтов, а также генов, продукты которых принимают участие в этом процессе. Кроме того, плазмиды могут содержать гены устойчивости к антибиотикам (например, к ампициллину - ген атр^г) или другие маркерные гены, что позволяет проводить их эффективный отбор по данному признаку (рис. 4).

Для выделения плазмид используют клеточные культуры, как растущие в жидкой среде, содержащей соответствующий антибиотик, так и полученные наращиванием одной снятой с агара бактериальной колонии.

Для выделения плазмидной ДНК (пДНК) чаще всего используется представленный ниже щелочной метод, обладающий рядом преимуществ по сравнению с другими методами выделения пДНК: он недорогой, быстрый и позволяет получить ДНК высокого качества.

Принцип метода. В щелочных условиях происходит денатурация (разделение цепей) линейных молекул хромосомной ДНК, а кольцевые молекулы плазмидной ДНК этому процессу практически не подвергаются из-за своей компактной структуры, обусловленной суперскрученностью и малыми размерами. При нейтрализации клеточного экстракта в присутствии солей высокой концентрации происходит реассоциация одноцепочечных молекул хромосомной ДНК с образованием нерастворимых комплексов, которые выпадают в осадок. Таким образом, происходит разделение хромосомной и плазмидной ДНК. Удаление клеточной РНК и белков в процессе осаждения происходит под действием детергента (ДДС—№) и (или) гидролитическихферментов(РНКазы,протеиназы).

Рис. 4.

Схемастроенияплазмидноговектора рСЕМ^ф-32.Размер вектора —2743п.н. атр^г—генустойчивостикампициллину,1ас Ъ —фрагмент лактозного оперона кишечной палочки, оп точка начала репликации(стрелкойпоказанонаправлениерепликации. Штрихами обозначены сайты рестрикции различными рестриктазами)

Цель работы. Ознакомиться со щелочным методом выделения плазмидной ДНК.

Оборудование и материалы. 1. Микроцентрифуга высокоскоростная (до 10 000#). 2. Термостат твердотельный для микропробирок вместимостью 0,5— 1,5 мл. 3. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 4. Микропробирки вместимостью 1,5 мл. 5. Термостат твердотельный с функцией охлаждения для микропробирок вместимостью до 1,5 мл. 6. Петля микробиологическая. 7. ТЕ-буфер (10 мМ трис-ПС\, 1 мМ ЭДТА-№ рН 8). 8. 5 М раствор ацетата калия рН 4,8. 9. Изопропанал. 10. 70%-ный этанол. 11. ДНК плазмидырСЕМ-72Г. 12. ДНК плазмиды рСЕМ-32 с концентрацией 0,2; 0,5; 1,0мкг/мкл.13. Для проведения электрофореза используются материалы и оборудование,представленные в практической работе № 2.

Ход работы. 1. Готовят рабочие растворы I и II для выделения плазмидной ДНК (табл. 5, 6).