Практическая работа № 15 экстракция белков из животных и растительных тканей

По сравнению с выделением нуклеиновых кислот экстракция белков — менее сложный и трудоемкий процесс, который, однако, имеет свои ограничения. Для экстракции белков из тканей животных и растений нужно разрушить клеточные стенки и внут-риклеточные мембраны и очистить раствор белков от примесей(клеточных обломков), при этом требуется сохранить нативную структуру выделяемых белков, а для ферментов — их функциональную (каталитическую) активность. Поэтому при выделении белков не могут использоваться агрессивные лизирующие растворы и нагревание, чтобы избежать денатурации белков.

В качестве экстрагирующей жидкости обычно применяют 0,15 М раствор NaС1, для более полного выделения белков могут использоваться некоторые детергенты — Тriton Х-100, дезоксихолат натрия и др. Все процедуры экстракции проводят при постоянном охлаждении, что позволяет сохранить нативную структуру белков, а также избежать их ферментативной деградации со стороны эндогенных протеолитических ферментов, высвобождающихся в экстракт в ходе разрушения субклеточных структур. Очистку белковых экстрактов проводят чаще всего с помощью центрифугирования при достаточно высоких скоростях, используя рефрижераторные (с функцией охлаждения) центрифуги.

Учитывая вышеизложенное, крайне затруднительно без при-менения специальных методик выделить белки из твердых животных тканей (хрящей, костей, роговых покровов и т. д.). Желательно не использовать ткани, богатые липидами, мешающими экстракции белков. Для выделения белков предпочтительно использование тканей мышц и внутренних органов (печени, почек).

В отличие от получения экстрактов из животных тканей, при экстракции водорастворимых белков из тканей растений целесообразно использовать буферные растворы с добавлением антиоксидантов, что предохраняет белки растений от быстрого окисле-ния и позволяет получить их нативные препараты, пригодные для дальнейших исследований. Для работы модельным объектом растительного происхождения удобны водорастворимые белки, содержащиеся в клубнях и листьях картофеля.

Экстракты белков, учитывая присутствие в них протеолитических ферментов, хранят в замороженном состоянии (в бытовых морозильных камерах при температуре -18 °С) или менее продолжительное время (до 2 нед) в холодильнике при 2—8 °С.

Цель работы. Освоить методы экстракции белков из животных и растительных объектов.

Оборудование и материалы. 1. Рефрижераторная центрифуга (до 10 000 g) с угловым ротором для пробирок вместимостью 10—15 мл. 2. Весы лабораторные. 3. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 4. Студки фарфоровые с пестиками. 5. Кристаллизатор.6.Пробирки центрифужные вместимостью10—15 мл. 7. Пробирки стеклянные химические и пластиковые типа Эппендорф. 8. Воронки стеклянные. 9. Ножницы, скальпели. 10. Порошок кварцевого стекла. 11. Марля или капроновая ткань. 12. 0,15 М раствор NаС1 (хранить при температу ре 2—8°С). 13. 0,5%-ный раствор Тriton Х-100. 14. Тиосульфат натрия. 15. Сульфит натрия. 16. Сахароза. 17. Лед. 18. Дистиллированная вода. 19. Образцы животных и растительных тканей -

Ход работы. Получение экстракта водорастворимых белков из животных тканей.1.Навескумышечной ткани или печени животного (0,5—1 г) измельчить ножницами, перенести в фарфоровую ступку, добавить небольшое количество порошка кварцевого стекла и растирать до гомогенного состояния на холоде (для наиболее эффективного охлаждения ступку лучше поставить в кристаллизатор со льдом).

2.К гомогенату животных тканей добавить 10-кратный по отношению к взятой навеске объем 0,15М раствора NaС1(дляболееполного извлечения белков, в том числе и мембранно-связанных, в качестве экстрагирующей жидкости необходимо использовать 0,5%-ный раствор Тriton Х-100) и продолжать гомогенизацию в течение еще 20 мин.

3.Полученный экстракт белков отфильтровать через двойной слой марлевой или капроновой ткани, количественно перенести в центрифужные пробирки и центрифугировать при 6000—10000g и температуре 4 °С в течение 30 мин.

4.Супернатант (надосадочную жидкость) аккуратно, не взмучивая осадка, перенести в чистую пробирку. Если на поверхности водной фазы образовалась липидная пленка, операцию проводят при помощи автоматического дозатора. Полученный экстракт белков хранить при температуре —18 °С или в течение 1—2 нед при 2-8 °С.

Получение экстракта водорастворимых белков из растительных тканей. Экстракция белков из клубней картофеля. 1. Полностью сформированный клубень с отмершим столоном очистить от кожуры, взвесить, измельчить скальпелем и гомогенизировать 20 мин растиранием в фарфоровой ступке на холоде с 0,2-кратным по отношению к взятой навеске объемом раствора антиоксиданта (сульфитнатрия 4г,тиосульфат натрия 3г,дистиллированная вода до 100 мл) и равным объемом0,2Мтрис-НС1 буфера (рН 8,5), содержащего 20 % сахарозы.

2.Полученный гомогенат центрифугировать 15 мин при 10000g и температуре 4°С. Супернатант (экстракт белков клубней) отобрать и немедленно использовать для работы либо хранить при —18°С не более 1 нед в герметично закрытых микропробирках.

Экстракция белков из листьев картофеля. 1. Навеску измельченных ножницами свежих листьев(0,2—0,5г)гомогенизировать на холоде с 0,1-кратным по отношению к массе растительного материала объемом антиоксиданта (см. п. 1) и 2-кратным объемом 0,05 М трис-HCI буфера (рН 8,5), содержащего 20 % сахарозы.

2.Гомогенат выдержать при температуре 4°С в течение 1 ч, периодически встряхивая его для полной экстракции водорастворимых белков.

3.Гомогенат центрифугировать 45 мин при 10000g и температуре 4 °С. Полученный супернатант (экстракт белков листьев) немедленно использовать для работы или хранить при-18°С не более 1 нед в герметично закрытых микропробирках.

Полученные экстракты могут быть использованы для количественного определения концентрации белка по методам ЛоурииБрэдфорд (см. практические работы № 18, 19), для разделения содержащихся в них белков методом электрофореза в полиакриламидном геле (см. практические работы № 21, 22) и других практических работ.

Контрольные вопросы. 1. Какие экстрагирующие растворы могут применяться при выделении белков? 2. Почему экстракцию белков проводят при охлаждении? 3. Из каких животных тканей удобнее выделять белки и почему? 4. Каковы особенности выделения белков из растительных тканей?

Задания.1.Получить экстракт белков из животных тканей. 2. Получить экстракт белков из растительных тканей. 3. Определить концентрацию белка в полученных экстрактах методом Брэдфорд и сравнить содержание белка (в %) в животных и растительных объектах.