Мультисубстратные комплексы
Большинство ферментов катализирует реакции, в которых участвует более одного субстрата. В случае если кофермент не является простетической группой, его можно рассматривать как косубстрат или другими словами как второй субстрат. Следовательно, участников ферментативной реакции может быть несколько: собственно фермент, несколько субстратов и кофермент.
В случаях бисубстратных реакций механизм ферментативного катализа, как правило, может идти по одному из двух путей: по механизму «пинг-понг» (механизм двойного замещения) или последовательному механизму.
Механизм «пинг-понг» схематично может быть представлен следующим образом:
Связывание субстрата А с ферментом (Е) приводит к образованию фермент-субстратного комплекса ЕА, при этом субстрат А превращается в продукт (Р), который покидает фермент. В результате такого преобразования фермент остается в изменённой (Е') форме, в результате модификации кофермента. Далее в активном центре фермента происходит связывание субстрата В с образованием второго фермент-субстратного комплекса Е'В, последующим превращением субстрата В в продукт Q и высвобождением нативной формы фермента (Е).
Примером этого механизма являются реакции дегидрирования с участием коферментов FAD и FMN.
Последовательный механизм ферментативной бисубстратной реакции предусматривает взаимодействие с ферментом двух субстратов до их превращения в соответствующие продукты. В этом случае связывание субстратов возможно различными путями – упорядоченным или случайным способом.
Механизм упорядоченного взаимодействия субстрата с активным центром фермента:
Первым в активный центр фермента доставляется субстрат А, облегчая тем самым присоединение субстрата В.
После химического превращения этих субстратов так же в определённом порядке происходит высвобождение продуктов реакции (Р и Q). Примером такого механизма является реакция дегидрирования с участием коферментов NAD+ и NADP+.
Механизм случайного взаимодействия субстрата с активным центром фермента:
Приоритетности за взаимодействие субстратов А и В в активном центре фермента нет, так как каждый субстрат имеет свой центр связывания. Также нет строгой закономерности высвобождения продуктов реакции.
Количественное определение ферментативной активности
Определить количественное содержание фермента в биологических объектах достаточно трудно, т.к. он присутствует в тканях в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве фермента судят по скорости катализируемой им реакции в стандартных условиях (t = 25С, оптимальное значение рН, при полном насыщении фермента субстратом), и выражают в условных единицах.
За единицу активности фермента (Е – рус./нем. или U – англ./исп.) принимают такое количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту (1 мкмоль/мин). Эта стандартная международная единица выражения количества фермента и его активности введена в 1962 г. Международным биохимическим союзом. В Международной системе единиц Си (1972 г.) предложена, вместо старой безымянной единицы ферментативной активности (Е или U), новая единица ферментативной активности – катал. 1 катал – это количество фермента, обеспечивающее превращение 1 моля субстрата в 1 секунду в стандартных условиях. Поскольку реакции идут гораздо с меньшей скоростью, то активность выражают в микро-, нано- и пикокаталах. 1Е = 16,67 нкат.
Для характеристики активности ферментов на практике часто используют следующие понятия:
Удельная активность – это число единиц ферментативной активности на 1 мг фермента, т.е. число мкмолей субстрата, превращаемое в 1 мин /1 мг фермента. Удельная активность выражается также числом каталов на 1 кг фермента (кат/кг);
Молярная активность – выражается в каталах на 1 моль фермента;
Молекулярная активность – это число молекул субстрата, превращенное в 1 мин 1 молекулой фермента. Например, молекулярная активность каталазы = 5 мин;
Концентрация фермента – выражается в единицах ферментативной активности Е на 1 мл раствора.