Лабораторно-практическое занятие «Определение содержания нитратов в биологическом объекте»
Метод определения нитритов и нитратов (после восстановления в нитриты) основан на фотометрическом измерении интенсивности окраски водного извлечения их из исследуемых проб азосоединения розово-малинового цвета, образующегося при реакции нитритов с α-нафтиламином и сульфаниловой кислотой (реактив Грисса) в кислой среде после водного извлечения их из исследуемых проб. Реакция специфична для нитритов.
Предел определения нитритов составляет 0,05 мг/кг (мг/л), степень определения нитритов 90 ± 10%.
Предел определения нитратов составляет 0,5 мг/кг (мг/л), степень определения нитратов 83 ± 17%.
Задание 1. Провести выделение токсических веществ из биологического объекта.
Измельченный растительный материал (картофель, лук, капуста, зелень и др.) в количестве 2-10 г помещают в диализационный цилиндр (стеклянную трубку с мембраной). Отмеривают 100 мл дистиллированной воды в стакан и помещают туда диализационный цилиндр с биоматериалом, предварительно смочив его несколькими миллилитрами дистиллированной воды из первоначального объема воды в стакане. Воды приливают столько, чтобы она хорошо смочила пробу. Проводят диализ в течение 1,5 - 2 часов.
Не вынимая диализационного цилиндра из стакана, пипеткой отбирают 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты.
Количественное определение нитритов.
К 10 мл диализата, помещенного в пробирку добавляют 1 мл реактива Грисса, встряхивают содержимое пробирки. Через 15 мин. определяют оптическую плотность полученного раствора при λ = 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.
Количественное определение нитратов.
К 5 мл диализата, помещенным в пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно помещают 0,3 г сухого восстановителя, приливают 5 мл 12% уксусной кислоты, закрывают пробирку пробкой и энергично встряхивают ее в течение точно 2 мин.
В параллельную пробирку помещают 0,3 г сухого восстановителя и приливают 10 мл 12% уксусной кислоты, закрывают ее пробкой и встряхивают в течение 2 мин. ("холостой" раствор).
Через 10 мин. переливают содержимое пробирок в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. После этого определяют оптическую плотность исследуемого раствора при λ = 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют "холостой" раствор - раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстановителем.
По калибровочным графикам находят содержание нитратов (нитрат - иона) и нитритов (нитрит – иона) и рассчитывают их концентрацию в исходном биологическом материале по формуле:
,
Где: Cкалиб – концентрация нитрит-иона (нитрат-иона), найденная по калибровочному графику, мкг;
Vдиал – объем диализата, мл;
Vаликв – объем аликвоты, взятой для анализа, мл;
m – масса навески биоматериала, г.
В том случае, если в пробах устанавливается наличие большого содержания нитритов - свыше 20 мкг (интенсивная окраска в пробирке), их следует удалять, так как они несколько завышают результаты определения нитратов. Для удаления нитритов к диализату в стакане, соответственно 50 или 100 мл, прибавляют 2 - 4 мл 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты, перемешивают раствор стеклянной палочкой и оставляют на 5 мин. После этого отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано выше. При расчетах учитывают увеличение общего объема пробы.
Построение калибровочных кривых
1. Построение калибровочной кривой для определения нитритов.
В 11 химических пробирок помещают рабочий раствор нитрита натрия в количествах, указанных в таблице. Объем в пробирках доводят дистиллированной водой до 10 мл. Приливают по 1 мл реактива Грисса и энергично встряхивают.
Таблица: Данные для приготовления стандартных растворов для определения нитритов.
№ пробирки |
Количество рабочего раствора NaNO2, мл |
Содержание NO2 |
|
мг |
мкг |
||
1 |
0,1 |
0,0005 |
0,5 |
2 |
0,2 |
0,0010 |
1,0 |
3 |
0,4 |
0,0020 |
2,0 |
4 |
0,6 |
0,0030 |
3,0 |
5 |
0,8 |
0,0040 |
4,0 |
6 |
1,0 |
0,0050 |
5,0 |
7 |
1,2 |
0,0060 |
6,0 |
8 |
1,4 |
0,0070 |
7,0 |
9 |
1,6 |
0,0080 |
8,0 |
10 |
1,8 |
0,0090 |
9,0 |
11 |
2,0 |
0,0100 |
10,0 |
Для построения калибровочной кривой через 15 мин. определяют оптическую плотность полученных растворов при λ = 540 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.
2. Построение калибровочной кривой для определения нитратов.
В 7 пробирок с притертыми пробками или в 7 центрифужных пробирок с притертыми пробками последовательно прибавляют по 0,3 г реактива для восстановления нитратов, затем приливают рабочий раствор и 12% уксусную кислоту в количествах, указанных в таблице (общий объем составляет 10 мл).
Таблица: Данные для приготовления стандартных растворов для определения нитратов.
№ пробирки |
Количество рабочего раствора NaNO2, мл |
Содержание NO2 |
Кол-во 1% уксусной кислоты, мл |
|
мг |
мкг |
|||
1 |
0,0 |
0,0 |
- |
10,0 |
2 |
1,0 |
0,010 |
10 |
9,0 |
3 |
2,0 |
0,020 |
20 |
8,0 |
4 |
4,0 |
0,040 |
40 |
6,0 |
5 |
6,0 |
0,060 |
60 |
4,0 |
6 |
8,0 |
0,080 |
80 |
2,0 |
7 |
10,0 |
0,100 |
100 |
0,0 |
Затем пробирки или центрифужные пробирки закрывают пробками и энергично встряхивают в течение ровно 2 мин. Через 10 мин. пробы центрифугируют в центрифужных пробирках при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. После этого определяют оптическую плотность исследуемого раствора при λ = 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют "холостой" раствор - раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстановителем