22 Вопрос (Дыхание микроорганизмов. Особенности энергетического обмена у аэробов и анаэробов).
23 Вопрос (Методы культивирования анаэробов).
Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо создание бескислородных условий, достигаемое различными методами.
Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах — анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика сахарного агара или среды Вильсона — Блера, налитых в пробирки в расплавленном состоянии и остуженных до 43°С. По методу Вейона — Виньяля расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.
Химические методы заключаются в том, что при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. В жидкие питательные среды можно добавлять различные редуцирующие вещества: аскорбиновую или тиогликолевую кислоту.
Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закупоренных. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта — Тароцци. В нее входят сахарный МПБ, который наливают в пробирки в количестве 10—12 мл, и кусочки вареных паренхиматозных органов. Перед употреблением среду Китта ,— Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного в ней кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов (помутнение) может наблюдаться через 48 ч и более в зависимости от количества посевного материала.
Рост изолированных колоний анаэробов можно получить при рассеве исследуемого материала по поверхности кровяно-сахарного агара, разлитого в чашки Петри. После посева чашки помещают в анаэростат. Исследуемый материал в убывающей концентрации можно засевать в высокий столбик агара. Образовавшиеся отдельные колонии анаэробов выделяют, распилив пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного количества биомассы отсевают затем на среду Китта — Тароцци. В качестве источника энергии для анаэробов используют глюкозу, добавление которой в питательную среду обязательно.
24 Вопрос (Понятие о чистой культуре. Выделение чистых культур аэробных бактерий).
Для выращивания аэробов необходимы питательные среды, создание оптимальных температурных условий и наличие кислорода. Обычно рост бактерий в виде помутнения жидких питательных сред или образования колоний на плотных средах наблюдается через 18—24 ч культивирования в термостате. Для того чтобы изучить морфологические, культуральные, ферментативные (биохимические) и другие свойства микробов определенного вида, необходимо получить его чистую культуру. Чистая культура — микроорганизмы одного вида, полученные из одной или нескольких клеток в результате размножения на искусственной питательной среде. Существуют различные методы получения чистой культуры из микробных ассоциаций.
Для выделения изолированных колоний, из которых выращивают чистую культуру, небольшое количество исследуемого материала вносят петлей в расплавленный и остуженный до 43°С агар в пробирке, тщательно перемешивают и смесь выливают в чашку Петри. Микробы в форме изолированных колоний растут как по поверхности агара (аэробы), так и внутри него (анаэробы). Этот метод, предложенный Кохом, применяется в настоящее время для определения общего количества бактерий, находящихся в воде и пищевых продуктах.
Чистую культуру аэробов получают обычно, засевая каплю исследуемого материала на поверхность застывшего агара в чашке Петри. Каплю распределяют по всей чашке с помощью специального шпателя Дригальского или бактериологической петли. Из отдельных микробных клеток через 16—20 ч культивирования в термостате образуются изолированные колонии. Каждая колония — популяция микроорганизмов, развившаяся из одной бактериальной клетки определенного вида бактерий. Колонии бактерий имеют различные размеры (от 2 до 4 мм), округлую правильную или неправильную форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или фестончатые края и различную консистенцию. Колонии бактерий могут быть бесцветными или имеют белый, золотистый, красный, лимонно-желтый цвет за счет образования пигмента. Метод, предложенный Дригальским для выделения чистых культур аэробов, наиболее часто применяется и в настоящее время. Биологический метод получения чистых культур основан на заражении чувствительных экспериментальных животных исследуемым материалом, содержащим микробные ассоциации. Например, пневмококки можно выделить из мокроты, заражая чувствительную к ним белую мышь. Через 4 ч в крови мыши обнаруживают чистую культуру пневмококков, так как они опережают размножение других микроорганизмов.
Существуют различные способы разделения спорообразующих бактерий и неспорообразующих, подвижных и неподвижных, устойчивых к кислотам и чувствительных к ним. Например, прогревание исследуемого материала перед посевом убивает все вегетативные формы бактерий и позволяет выделить чистую культуру споро- образующих бактерий. Подвижного микроба-протея можно выделить по способу Шукевича. Для этого делают посев в конденсационную воду на дне пробирки со скошенным агаром. Хорошо подвижный протей дает ползучий рост вверх по поверхности агара. Используя обработку исследуемого материала кислотой (при короткой экспозиции), можно выделить микобактерии туберкулеза, устойчивые к кислотам.