Ферментнтативные методы

Более специфичны, так как основаны на ферментативном превращении глюкозы. Используются 3 основные ферментативные реакции:

1. Глюкозооксидазная

2. Гексокиназная

3. Глюкозодегидрогеназная

Глюкозооксидазный метод основан на глюкозооксидазной реакции. Глюкозооксидаза катализирует перенос двух атомов водорода с первого углеродного атома на кислород, растворённый в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода. Т.е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Поскольку глюкозооксидаза высо­коспецифична по отношению к бета-D-глюкозе, большинство препаратов фермента содержат фермент мутаразу, катализирую­щую превращение альфа-D-глюкозы в бета-форму.

_ГО

Г люкоза + О₂ Глюконовая кислота + Н₂О₂

В зависимости от способа индикации перекиси различают глюкозооксидазный метод:

1. С колориметричеким завершением

2. С кинетическим методом фотометрирования

3. Хемилюминисцентный

4. С амперометрическим завершением (злектрохимический)

5. Методы «сухой» химии.

Ферментативные глюкозооксидазно-пероксидазные методы с колориметрическим завершением («ручные», выполняемые на измерительной фотометрической аппаратуре прежнего образца: типа КФК-2МП и другой аналогичной) являются гораздо более специфичными, чем аналогичные неферментативные.

Здесь используются две сопряженные энзимные реакции. Первая реакция осуществляемая глюкозооксидазой, указана выше и является специфической (лимитирующей) реакцией. Перекись во­дорода, образующаяся в процессе глюкозооксидазной реакции, используется для проведения второй, неспецифической (индикаторной) реакции, в которой молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О₂^-, который в свою очередь окисляет хромоген. Оптическая плотность формирующегося окрашенного соедине­ния измеряется фотометрически. В качестве индикатора наиболее широко применяется 4-аминофеназон (р-аминофеназон, р-амаксантипирин, ПАП). Глюкозопероксидазная реакция с использованием 4-аминофеназона как финального акцептора перекиси водорода мониторируется (регистрируется) в области длин волн 500—525 нм (метод конечной точки).

Ортотолуидиновый ме­тод определения содержания глюкозы все более уступает глюкозопероксидазным ПАП-методам (Триндер, 1969). В ходе реакции Триндера 4-аминоантипирин окисляется кислоро­дом, образующимся при разложении перекиси водорода; в из­бытке фенола (гидроксибензойной кислоты, гидроксибензоата или других близких по структуре веществ) это окисленное соеди­нение образует окрашенный хромоген — хинон (розово-малино­вого цвета), количество которого пропорционально содержанию присутствующей в пробе глюкозы. Цветной комплекс фотометрируется при 500 нм (490—520 нм). По данным разных авторов, он стабилен в течение от 15—30 до 45—60 мин при комнатной температуре.

Линейный диапазон измеряемых данным методом концентраций глюкозы в сыворотке, плазме, цельной крови и моче достаточно широк – 2-27 ммоль/л; погрешность определения не более 8%.

При использовании ручного метода (выполняемого с приме­нением водяной бани, при температуре 37°С) замер абсорбции может быть осуществлен на обычной фотометрической аппарату­ре.

Недостаток глюкозооксидазного метода является то, что не только образующаяся перекись водорода и супероксид анион-радикал могут окислять хромоген, но и другие вещества, присутствующие в биологической жидкости: аскорбиновая кислота, мочевая кислота, билирубин и цистеин. При этом, соответственно, доля перекиси, принимающая участие в окислении хромогена, снижается, что приводит к занижению результата по глюкозе. Результаты так же занижаются такими препаратами как ацетилсалициловая кислота, леводопа, гентизиновая кислота. Формальдегид ингибирует глюкозооксидазную реакцию.

Суть кинетического метода фотометрирования состоит в том, что при определённом соотношении активностей глюкозооксидазы и пероксидазы, скорость образования окрашенного соединения некоторое время после внесения пробы в рабочий раствор будет пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Преимущество такого метода состоит в том, что результат не зависит от наличия в пробе других соединений, поскольку поглощение последних стабильно во времени.

Хемилюминисцентный метод имеет 2 варианта.

Имеет 2 разновидности:

1. Пероксидазная реакция катализирует химический процесс, происходящий между перекисью водорода, 3,5-дихлор-2-гидроксибензенсульфоновой кислотой и 4-аминоантипирином с образовани­ем хромогенного продукта. Однако реакция мониторируется не по измерению интенсивности окрашивания этого продукта, а по его способности ослаблять флюоресценцию присутствующего в реакционной смеси люминесцентного красителя флюоресцеина. Ослабление флюоресценции прямо пропорционально содержа­нию глюкозы, или содержание глюкозы обратно пропорциональ­но интенсивности измеряемой флюоресценции.

2. Прямое определение глюкозы в крови с по­мощью люминола основыва­ющееся на использовании пероксидгенерирующей системы (глюкозы и глюкозооксидазы) с последующим ферментативным окислением люминола пероксидазой хрена, что сопровождается хемилюминесценцией.

Большие успехи достигнуты и в создании принципиально но­вых аналитических систем, использующих принцип электрохи­мического определения продуктов ферментативной реакции окис­ления глюкозы. Основным их элементом являются исключитель­но чувствительные и селективные ферментные электроды.

В анализаторах, предназначаченных для определения глюкозы, применён глюкозооксидазный ферментный электрод. С помощью амперометрических датчиков регистрируется скорость образования перекиси водорода (или потребления кислорода).

Одним из лучших образцов приборов, использующих электрохимическое определение глюкозы, являются анализаторы фирм «Бекман», «Йеллоу Спрингс». В странах СНГ получил известность «ЭКСАН-Г» (Литва) и его модификация – «ЭКСАН-Г-И».

Основными элементами подобных приборов являются Н₂О₂-электрод, состоящий из платинового, имеющего форму диска (диаметром 1,5-2,0 мм) анода и хлорсеребряного электрода сравнения, выполненного в виде кольца, окружающего платиновый электрод. Непосредственно к электроду прилегает трёхслойная ферментная мембрана (для удобства использования она приклеена к резиновому кольцу, с помощью которого надевается на торец электрода). Первый, ацетатцеллюлозный слой затрудняет диффузию органических соединений (аминокислот, аскорбиновой кислоты и др.), могущих подвергаться электрохимическим превращениям при потенциале окисления Н₂О₂. Тем самым она служит повышению селективности электрода, так как пропускает к поверхности его преимущественно газы и нейтральные молекулы небольшой молекулярной массы (Н₂О₂, О₂, СО₂, Н₂О, Н₂ и т.д.). Второй слой содержит глюкозооксидазу, иммобилизированную в геле при помощи глютарового альдегида. В этом слое происходит ферментативное окисление глюкозы с образованием Н₂О₂ и глюконолактона. Третий слой представляет собой лавсановую плёнку с порами диаметром около 1 мкм, служащую для защиты ферментного слоя от загрязнения белками, клетками крови, а также для придания механической прочности мембране.

Ферментный датчик с мембраной закреплён в стенке заполненной буфером ячейки объёмом 1 мл. При введении дозаторной пипеткой 50 мкл исследуемой пробы она разбавляется буферным раствором в 20 раз. Перемешивание пробы в измерительной ячейке осуществляется при помощи магнитной мешалки, а удаление отработанного раствора, промывка ячейки и заполнение её буфером – с помощью двухканального перистальтического насоса. При введении в измерительную ячейку пробы, содержащей глюкозу, образующая в ферментной мембране перекись водорода окисляется на рабочем электроде, вызывая увеличение анодного тока. Сигнал датчика поступает последовательно в электронный блок и трёхзначный цифровой индикатор, отражающий показатели концентрации глюкозы в крови (ммоль/л).

Большое число методов с использованием иммобилизован­ной глюкозооксидазы автоматизированы. Чаще всего для этой цели применяют проточные анализаторы, потенциометрические анализаторы с ферментативными электродами или анализаторы, использующие сухую пленочную технологию.

Методы «сухой» химии.

Полуколичественное и количественное экспресс-определение глюкозы в крови и моче с использованием методологии «сухой» химии основано на визуальной либо объектив­ной фотометрической индикации продуктов, образующихся в процессе ферментативного (с использованием глюкозооксидазы) окисления глюкозы исследуемой биологической жидкости.

Для полуколичественной, скрининговой оценки содержания глюкозы в крови и моче обычно используются тест-полоски, позволяющие наряду с глюкозой устанавливать содержание не­которых других, имеющих значение для диагностики заболева­ний метаболитов.

Диагностические полоски «МеллиФАН» применяются с целью быстрого полуколичественного определе­ния содержания глюкозы в крови больных сахарным диабетом — как в общей клинической практике, так и для осуществления са­моконтроля больными сахарным диабетом. Принцип действия основан на использовании сопряженных ферментативных ре­акций, катализируемых ферментами глюкозооксвдазой и пероксидазой.

Тест-полоска «Глюко-Уротест», предназначенная для качественного экспресс-анализа глюкозы в моче, представляет собой полоску ватмана или другого полимерного материала: полистирола, полиэтилентерефтолата, триацетилцёллюлозы (подложка) с наклеенным аналити­ческим элементом в виде квадрата светло-бежевого, светло-розо­вого или желтого (в зависимости от используемого красителя), выполненного из любого фильтрующего материала. Элемент пропитан активным раствором.

Выявление и полуколичественное определение глюкозы ос­новано на окислении D-глюкозы в присутствии глюкозооксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водоро­да. Под действием пероксидазы хрена перекись водорода окисля­ет краситель, что приводит к изменению бледно-розовой окраски аналитического элемента на ярко-розовую.

Тест-полоску погружают в исследуемую мочу на 1—2 с и вы­нимают; каплю мочи, оставшуюся на полоске, удаляют, проведя гранью полоски по краю сосуда, и выдерживают на воздухе от 1 до 3 мин. Визуально оценивают цвет аналитического элемента. Переход светло-бежевого цвета в синий, светло-розового в красный, желтого в зеленый учитывают как положительный резуль­тат. «Положительные» пробы мочи направляются на количес­твенное исследование.

Чувствительность «Глюко-Уротеста» — 1,4—5,6 ммоль/л, или не более 0,1% массовой доли глюкозы в исследуемой моче.

Тест-полоски на мочу могут применяться для:

* рутинных исследований в стационарах и поликлиниках;

* мониторинга проводимой терапии и рецидивов;

* самообследования (больные сахарным диабетом, беременные);

* в профилактической медицине для:

- скрининг-тестов на выявление нарушений обмена веществ;

- экспресс-диагностики;

- обследовании при поступлении на работу; профосмотрах;

- обследовании призывников.

При использовании тест-полосок ложноположительные результаты наблюдаются при попадании в мочу перекиси водорода, гипохлорита (хлорной извести), вследствие окис­ления ими хромогена, длительного стояния мочи на воздухе в открытом сосуде, использования вагинальных порошков, содержащих глюкозу.

Для объективизации оценки результатов при использовании методов «сухой» химии применяют «глюкометры» (обычно пор­тативные, часто умещающиеся на ладони приборы, дающие циф­ровую информацию о содержании глюкозы в крови и моче). Рассмотрим работу глюкометров на примере приборов «ONE TOUCH».

Глюкометры «ONE TOUCH» предназначены для быстрого и точного измерения уровня глюкозы в цельной крови. Тест-полоска «ONE TOUCH» содержит все необходимые химические компоненты для двухэтапного глюкозооксидазного метода, включая ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, которые сорбированы на уникальную пористую гидрофильную мембрану. Результатом реакции является образование окрашенного комплекса. Интенсивность развившейся окраски регистрируется отражательным минифотометром.

Тест-полоска «ONE TOUCH» имеет уникальное строение. Её мембрана напоминает губку с микроскопическими порами и выполняет тройственную функцию:

1. Действует как резервуар, собирая необходимое количество крови,

2. Действует как фильтр, блокируя твёрдый клеточный материал (эритроциты, лейкоциты и др.),

3. Имеет гладкую оптическую поверхность, на которой измеряется отражённый свет.

Последняя функция, в частности, очень важна для работы прибора. Она делает возможным считывать нижнюю часть полоски, тогда как кровь остаётся на верхней части тест-полоски.

В дополнение ко всему мембрана обладает гидрофильными свойствами, благодаря которым капля крови «притягивается» к поверхности тест-полоски при касании.

Схема 1. Конструкция тест-полоски

В состав приборов «ONE TOUCH» входит два специальных светодиода. Обработка развившейся окраски на тест-полоске идёт следующим образом. Как только тест-полоска вставлена в прибор – происходит нулевое считывание. В этот момент на дислее мы видим: «ЖДАТЬ». Когда капля крови наносится на тест- полоску, плазма крови моментально сорбируется мембраной, тогда как эритроциты и излишки плазмы остаются на поверхности мембраны. Когда капля полностью впитывается в мембрану, немедленно происходит окрашивание. Прибор регистрирует изменение в величине отражения и автоматически запускает таймер. Через 45 секунд химическая реакция заканчивается, результат светоотражения обрабатывается. Окрашенный продукт реакции поглощает свет, испускаемый первым светодиодом. Форменные элементы крови и лишняя плазма также поглощают свет, излучаемый диодом. Чтобы скорректировать фоновое отражение, второе считывание производится вторым светодиодом на другой длине волны. Разность сигналов от первого и второго светодиода несёт информацию о поглощении света хромогеном. Сигнал, полученный от хромогена для оценки концентрации глюкозы, соотносится со специальной калибровкой. Достаточно сложно наладить производство тест-полосок, которые были бы абсолютно одинаковыми химически, в силу очень низкой концентрации реактивов. Для решения этой проблемы используется стандартная калибровочная кривая, состоящая из 16-ти калибровочных линий. Контроль качества осуществляется сразу после производства тест-полосок, что позволяет определить, какая из калибровочных линий (от 1 до 16) может быть применена для данной тест-полоски. Это так называемый номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок. Для получения оптимально точных результатов, номер кода, который проставляется на упаковке тест-полосок, выставляется на приборе при помощи кнопки кода. Таким образом, неправильно установленный код на приборе может явиться причиной ошибки измерения.

Гексокиназный метод

Энзиматические УФ-методы с ручным и автоматизированным определением концентрации глюкозы (предложенные еще в на­чале 40-х' годов нашего столетия) базируются на гексокиназной реакции. Гексокиназный метод ключает в себя две сопряженные реакции:

гексокиназа

Г люкоза + АТФ глюкозо-6-фосфат + АДФ

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Г люкозо-6-фосфат + НАД⁺ 6-фосфоглюконат + НАДН + Н⁺

Гексокиназный метод является кинетическим (по типу теста Варбурга) и часто выполняется в режиме осуществления бихроматических исследований.

Реакция регистрируется при 340 нм по образованию НАДН.

Если ранее в наборах реагентов использо­валась глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа млекопитающих, то в настоящее время более широко применяются энзимы бактерий и окисленный НАД (чем окисленный НАДФ). Преимущество ис­пользования бактериальных энзимов состоит в том, что клетки тканей и эритроциты содержат наряду с глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой и 6-фосфоглюконатдегидрогеназу, использующие НАДФ в качестве субстрата. Несмотря на то, что некоторые гексозы могут вступать в гексокиназную реакцию, их концентрация в сыворотке (плазме) крови людей обычно очень низка. Поэтому они не способны значительно интерферировать с глюкозой.

Гексокиназный метод считается референтным для определения глюкозы. По сравнению с глюкозопероксидазным этот ме­тод позволяет получить результаты за меньший промежуток вре­мени (3 мин, без учета подготовительных и других процедур), даёт меньшую интерференцию с другими компонентами сыворотки крови, сохраняет линейность до 50 ммоль/л. Од­нако он более дорогой по себестоимости, требует применения фотометра с возможностью измерения в ультрафиолетовом спектре, снабженного термостатируемым кюветным отде­лением, либо биохимического (полу)автоанализатора.

При использовании гексокиназного метода ре­зультаты занижаются глюкозо-1-фосфатом, фруктозо-1-фосфатом, глутатионом.

Глюкозодегидрогеназный метод

Основан на реакции с глюкозодегидрогеназой:

ГлДГ

Г люкоза + НАД⁺ + Н₂О Глюконовая кислота + НАДН + Н⁺

Имеет те же особенности, что и гексокиназный метод.

14