12. Каковы преимущества и недостатки механического разрушения клеток по сравнению с химическим.

  Для разрушения клеток используют разнообразные химические, биологические ифизические методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в тоже время достаточно мягкими, чтобы исключитьденатурацию белка. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из разных полимеров, никакого универсального метода их разрушения не существует.

Химические методы разрушения клеточных стенок включают обработку щелочью, органическими растворителями или детергентами. Если белковый продукт не разрушается при pH от 10,5 до 12,5, то можно без труда и дешево ли-зировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантныйгормон роста человека очень просто выделить из клеток Е. соИ обработкой гидроксидом натрия при pH И. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов. Обработка органическими растворителями - это простой и недорогой способ разрушения клеток, который используется для выделения ферментов из дрожжей. Однако, чтобы убедиться в том, что в подобранных условиях белковый продукт не денатурирует, необходимо провести предварительное тестирование. Под действием детергентов в мембранах бактериальных клеток образуются поры, через которые белки и другие молекулывыходят из клетки. К сожалению, детергенты дороги, в больщинстве случаев в ихприсутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт.

После разрушения клеток их осколки удаляют либо низкоскоростным центрифугированием больших объемов, либо микрофильтрацией через мембрану.Белковый продукт осаждают из грубого или осветленного лизата органическими растворителями (спиртом или ацетоном) или сульфатом аммония. Достигаемое при этом обо-гашение — 2—5 раз. К сожалению, дороговизна

 В-третьих, многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Часто задача состоит в том, чтобы выделить тот или иной биополимер в нативном, т.е. сохраняющем биологическую активность, состоянии. Между тем многие белки и высокополимерные нуклеиновые кислоты при умеренных температурах и незначительных изменениях pH среды подвержены необратимому изменениюконформации — денатурации, которая обычно сопровождается потерейбиологической активности — инактивацией. Кроме того, в клетках частонаходятся ферменты, способные разрушать те или иные вещества. В первую очередь это относится к белкам и нуклеиновым кислотам, так как клетки обычно содержат ферменты, способные катализировать гидролиз этих биополимеров, — протеазы и нуклеазы. В неповрежденных клетках эти ферменты преимущественно сосредоточены в специальных гранулах — лизосомах. Однако при разрушении клеток или тканей, которое всегда предшествует началу работ по выделению интересующих исследователя веществ, лизосомы обычно разрушаются, ферменты выходят наружу, что приводит к быстрому разрушению биополимеров уже в исходной биомассе. 

Еше один механический метод разрушения клеток — соударение. Клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность или навстречу потоку другой суспензии. В месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Таким способом спомощью устройства под названием Mi roflmdizer за один прием была разрушена большая часть клеток Е. соИ в двух встречных потоках суспензии. Однако для разрушения клеток других микроорганизмов может понадобиться большее числораундов. В отличие от гомогенизаторов под высоким давлением и высокоскоростных шаровых мельниц, в которых, как правило, используются концентрированные клеточные суспензии, данное устройство пригодно для обработки любых суспензий. Как показали предварительные исследования,активность клеточных белков уменьшается при разрушении клеток по этой методике лишь незначительно, А если обработать суспензию клеток небольшим количеством лизоцима, а затем использовать устройство Mi rofluidizer в режиме пониженного по сравнению с обычным давления и при небольшой вязкости, то сохранится активность некоторых лабильных белков, инактивирующихся при высоком давлении.