21. Криоконсервация, как метод хранения и транспортирования клеточной культуры животных.

Криоконсерва́ция (от греч. κρύος — холод и лат. conservo — сохраняю) — низкотемпературное хранение живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:

- вид и тип клеток,

- их концентрация в суспензии,

- состав среды для консервирования,

- вид и концентрация криопротектора,

- режим охлаждения и отогрева,

- способ реабилитации клеток после отогрева.

Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого быдла во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методам консервации эмбрионов является их глубокой заморахивание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.

Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов моей шеренга перевесов. Отпадает необходимость во удержания больших стад или групп реципиентов, ведь пересадки могут быть проведенные в любое время независимо от терминов взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Помимо того, криоконсервация эмбрионов позвозяет создавать эмбриобанки от генетическо ценных животных, а тоже сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По пометке специалистов криоконсервация эмбрионов экономично оправданная, она исключает генетический дрейф, т.е. смена частоты генов в популяции, вызываемые случайными причинами.

22. Описать процесс замораживания и размораживание культур клеток животных.

 Анабиоз имеет место и при замораживании клеток, когда свободная вода внутри клетки превращается в лед, И в этом случае физиологические процессы максимально замедляются или даже прекращаются, так как биохимические реакции в твердой фазе льда идти не могут из-за отсутствия свободного движения молекул. При замораживании клеток, особенно медленном, образуются крупные кристаллы льда внутри клетки, которые могут вызвать повреждения клеточных структурных элементов. Следовательно, клетки надо обезвоживать или замораживать так, чтобы не допустить необратимые изменения в них, в противном случае наступает летальное состояние — смерть, а не анабиоз.

1-й этап: от +20 до -28oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35оС), выдерживают при этой температуре 15 минут.

2-ой этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196oC).

Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии - на спиртовой бане (0,5 - 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32oC (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32оС). Далее переносят ампулы в жидкий азот.

При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37 - +40оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты.

После размораживания клетки отмывают либо в ростовой среде (животные), либо в поддерживающей среде. Растительные клетки также можно отмывать 3 - 10% раствором сахарозы.

Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры.

Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной.