Масляно-водные и водно-масляные эмульсии

Представителями современных адъювантов этой группы являются: Монтанид, Адъювант 65 (Ad 65), Липовит, MF59, Drаcеol (ISA-51); ISA-720; SBAS-2; CFA35; ASO3 и другие.

Эмульсии, образованные частицами масла в воде, обеспечивают создание депо антигена в месте инъекций с медленным, постоянным и длительным высвобождением вакцинного антигена. Частицы масла в воде являются сильными провоспалительными агентами (ирритантами) и вызывают локальное воспаление, сопровождающееся индукцией хемотаксических сигналов, привлекающих макрофаги в очаг воспаления. Частицы масла вместе с ассоциированным антигеном поглощаются, макрофаги затем перемещаются в дренирующий лимфоузел, стимулируя в нем синтез антител против вакцинного антигена, а также вызывая индукцию Т-клеточного типа адаптивного иммунного ответа. Начавшись в регионарных лимфоузлах, этот процесс распространяется затем на отдаленные лимфоузлы и селезенку, где создаются новые очаги синтеза антител.

Масляно-водные эмульсии оказывают сильный адъювантный эффект, но обладают высокой реактогенностью: при инъекциях они вызывают сильную локальную воспалительную реакцию и весьма болезненны. В месте инъекции вакцин, содержащих этот тип адъювантов, возможно возникновение реакций по типу гиперчувствительности замедленного типа, включая нодулы, цисты и стерильные абсцессы, требующие хирургического удаления. В связи с этим применение данного типа адъювантов в профилактических человеческих вакцинах сильно ограничено, и поэтому они используются главным образом в ветеринарии и при создании человеческих противораковых и терапевтических вакцин, включая вакцины против ВИЧ.

Классическим примером масляно-водной эмульсии является адъювант Фрейнда, в состав которого входят минеральные масла (неполный адъювант Фрейнда), а также микобактерии туберкулеза (полный адъювант Фрейнда). Полный адъювант Фрейнда вызывает существенное возрастание синтеза комплемент-активирующих антител и стимуляцию клеточного типа адаптивного иммунного ответа. Однако из-за высокой реактогенности он применяется в настоящее время только в вакцинах для животных.

Адъюванты бактериального происхождения

Данная группа адъювантов является весьма перспективной. Это связано с крупнейшим прорывом в изучении адъювантов – открытием в 1997 году специальных рецепторов (TLR), распознающих так называемые патоген-ассоциированные молекулярные структуры. Эти Толл-подобные рецепторы, расположенные на поверхности и внутри дендритных клеток и макрофагов, предназначены для распознавания таких характерных структур микроорганизмов, как, например, белок флагеллин, содержащийся в жгутиках многих совершенно различных бактерий. Именно Толл-подобные рецепторы, которые называют еще патоген-детектирующими, обеспечивают так называемый сигнал опасности, активирующий ДК и МФ и стимулирующий в них разные типы реакций в зависимости от того, какие TLR детектируют данный тип ПАМС. Например, TLR-4 распознает липополисахариды, а TLR-7 – однонитчатую РНК, типичную для некоторых вирусов. После этих открытий стало ясно, что микробные производные и экстракты действуют как иммуностимулирующие адъюванты потому, что они стимулируют соответствующие Толл-подобные рецепторы антигенпредставляю-щих клеток. Раскрытие этих механизмов позволило понять, что можно направленно использовать бактериальные адъюванты и их комбинации для получения нужного типа иммунного ответа за счет стимуляции определенных Толл-подобных рецепторов.

Исследования в этой области позволили идентифицировать и оценить природные, а также создать новые синтетические или модифицированные адъюванты этого класса для модулирования иммунного ответа на определенные патогены или в каких-то определенных человеческих популяциях. Экспериментальные достижения иммунологии позволяют ученым удалить или модифицировать химические группировки и элементы, вызывавшие нежелательную токсичность ранее применявшихся адъювантов, а также разработать такие их смеси, которые обладали бы нужным набором свойств.

Адъюванты нового поколения

Многие современные адъюванты созданы фактически на основе развития и усовершенствования ранее применявшихся классических адъювантов традиционных вакцин. Однако в последнее время, в связи с созданием принципиально новых классов вакцин, которое обусловлено быстрым развитием современной иммунологии, были разработаны новые адъюванты и адъювантные комплексы, основанные на совершенно иных механизмах действия. Остановимся на некоторых из них.

Иммуностимулирующие комплексы

Иммуностимулирующие комплексы бывают нескольких типов. Один из них предназначен для конструирования мультивалентных синтетических пептидных и субъединичных полисахаридных или пептидных вакцин, содержащих Т-клеточные и В-клеточные эпитопы, введенные в специально разработанные макромолекулярные комплексы: твердый матрикс – моноклональные антитела против Т- и В-клеточных эпитопов – вакцинные антигены (эпитопы). В качестве твердого матрикса могут быть использованы наносферы из чистого углерода, на которые не реагируют иммунокомпетентные клетки, они могут также быть изготовлены из нуклеиновых кислот, биодеградируемых полимеров, а также из ветвистых «дендримеров», к которым легко прикрепить различные необходимые молекулы. Такие комплексы обозначаются SMAA, они обеспечивают доставку вакцинных эпитопов внутрь клеток, где происходит их процессирование и представление в комплексе с МНС-белками I класса. Эти мультивалентные комплексы и применяются в качестве вакцин, их структура в виде частиц обеспечивает высокую иммуногенность, так как облегчает поглощение их макрофагами и дендритными клетками. SMAA-комплексы индуцируют сильный гуморальный и Т-клеточный адаптивный ответ против эпитопов соответствующих патогенов.

Липосомы, виросомы и белковые мицеллы в качестве адъювантов. При создании современных мультивалентных пептидных вакцин конструируют адъюванты, содержащие антигены, инкорпорированные в белковые мицеллы, липидные везикулы (липосомы) или в виросомы. Для формирования мицелл и липосом с инкорпорированными пептидными эпитопами используются неионные детергенты.

Пептиды размешивают в растворе детергента, затем при удалении детергента происходит формирование мицелл. Пептидные молекулы само-ориентируются своими гидрофильными остатками в сторону водного окружения, а гидрофобными остатками – в центр образующейся мицеллы, таким образом исключается их взаимодействие с водной средой.

Липосомы, содержащие пептидные антигены, готовят, смешивая антигенные пептиды с суспензией фосфолипидов или других липидов в условиях, обеспечивающих формирование двуслойных липидных везикул-липосом. Пептиды гидрофобными остатками инкорпорируются в липидный бислой, при этом гидрофильные остатки ориентированы наружу. При контакте с клеточной мембраной макрофагов липосома сливается с ней, высвобождая антигенный пептид, который может соединяться с белками МНС I класса и активировать цитотоксические CD8⁺ Т-лимфоциты. Липосомы могут быть изготовлены таким образом, чтобы они имели различные зарядовые характеристики. Так, катионные липидные везикулы, включающие катионные производные холестерина и нейтральные фосфолипиды, способны связывать антиген на своей поверхности и тем самым улучшать его презентацию.

В качестве системных адъювантов используются также модифицированные протеино-липосомальные структуры, называемые кохлеатами. К поверхности липосом можно прикреплять различные молекулы, например, моноклональные антитела, которые обеспечивают «доставку» липосомы и ее содержимого к определенным клеткам. Вакцинные антигены, заключенные в липосомы, защищены от деградации и образуют депо, что позволяет увеличивать время экспозиции антигенпредставляющих клеток с антигеном.

Использование липосом в качестве адъювантов повышает и Т-клеточный, и гуморальный адаптивный ответ на белковые и полисахаридные антигены. Вакцины против гриппа и гепатита А, основанные на липосомах и виросомах, разрешены в Европе. Показано, что при вакцинации пожилых людей они лучше индуцируют образование цитотоксических Т-лимфоцитов, чем аналогичные вакцины без адъювантов. Вакцина INFLUSOM-VAC, которая содержит трехвалентную липосомную вакцину против гриппа с добавлением ИЛ-2, показала более высокую иммуногенность по сравнению со стандартной безадъювантной противогриппозной вакциной.

Вариантом такого рода адъювантов является создание полимерных ячеек, в которые заключен вакцинный антиген. Полимерами для создания таких ячеек могут служить как природные полисахариды, аналогичные полисахаридам клеточных стенок бактерий, так и синтетические полиэстеры. Польза этих материалов заключается еще и в том, что, во-первых, они сами обладают адъювантной активностью, реализируемой через Толл-подобные рецепторы, и, во-вторых, в них можно дополнительно включать природные или синтетические адъювантные молекулы, которые могут запускать необходимый тип межклеточной сигнализации между иммунокомпетентными клетками, участвующими в распознавании антигена и в индукции оптимального варианта адаптивного иммунного ответа.

Примером использования виросом (вирусоподобных частиц) в качестве адъюванта в составе вакцин может служить профилактическая и терапевтическая вакцина против папилломы человека, включающая рекомбинантные капсидные пептиды нескольких серотипов вируса папилломы человека в форме виросом. Эти пептиды длиной от 12 до 35 аминокислот моделируют структуру Т- и В-клеточных эпитопов трансформирующего белка Е7 вируса папилломы. Виросомы, подобно обычным вирусам, способны проникать в клетку, доставляя в нее антигенный материал с последующими процессированием и презентацией. Показано, что рекомбинантные виросомы индуцировали высокий уровень протективных антител и вызывали активацию как Т-хелперов, так и цитотоксических Т-лимфоцитов.

ISCOMS – иммуностимулирующие комплексы, представляют собой комплексы на основе липосом и могут включать антигены в виде белковых мицелл, они содержат экстрагированные антигены или мембранные пептиды различных патогенов, включая вирусы гриппа, кори, гепатита В, ВИЧ и другие. В ISCOMS длинные хвосты жирных кислот внешнего слоя, состоящего из детергента и QS-2 (сапонин), расположены напротив гидрофобных остатков антигенных пептидов, локализованных в центре комплекса. Образующиеся комплексы относительно стабильны, молярное соотношение QS-21, холестерина и антигена составляет примерно 1:1:1. Антигенами, включенными в ISCOMS, могут быть мицеллы, образованные пептидными антигенами: gp 120 ВИЧ, gP вируса Эпштейна-Барра, антигенами оболочек вирусов кори, бешенства, гепатита, белковыми антигенами малярийного плазмодия, возбудителя бешенства, опухолеспецифическими антигенами.

Таким образом, в состав ISCOMS входят: QS-21, стерол (предпочтительно холестерин), фосфолипид (обычно фосфатидилэтаноламин) и вакцинный антиген. ISCOMS, как и липосомы, сливаются с плазматическими мембранами клеток, обеспечивая доставку антигенов внутрь клеток, где они подвергаются процессингу с последующей презентацией антигенных пептидов в комплексе с МНС, индуцируя тем самым гуморальный и клеточно-опосредованный адаптивный иммунный ответ.

Так как ISCOMS представляют собой микрочастицы, они легко поглощаются макрофагами, где происходит их процессинг и презентация. Активированные макрофаги выделяют ИЛ-12, который индуцирует синтез IFN-γ в NK-клетках. Оба этих цитокина способствуют генерации Тх1, что определяет преимущественный профиль адаптивного иммунного ответа. После орального применения ISCOMS CD8⁺цитотоксические Т-лимфоциты были обнаружены в мезентериальных лимфоузлах и в селезенке экспериментальных животных, а также была показана индукция синтеза специфического IgA в слизистых.

Ограничения для применения ISCOMS в качестве адъювантов обусловлены в первую очередь их высокой стоимостью и проблемами стабильности. Необходимо также учитывать их реактогенность и определенную токсичность. При I фазе клинических испытаний человеческой противораковой вакцины, содержащей ISCOMS, были выявлены такие побочные эффекты, как гриппоподобные симптомы, лихорадка, повышенная возбудимость. Большая часть этих проявлений обусловлена содержащимся в ISCOMS QS-21.